SNT1396-2004弓形蟲(chóng)病間接血凝試驗(yàn).pdf

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1、SN中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1396-2004弓形蟲(chóng)病間接血凝試驗(yàn)Indirecthemagglutinationtestfortoxoplasmosis2004-06-01發(fā)布2004-12-01實(shí)施中華人民共和國(guó)、*V-*-.理曳〔』_“尤壓，勝守a-tin戶(hù)、4J、--‘從.-=.絲月勿c夕J飛氫拈莊幢了月寶立苛門(mén).立tt丈汽鄉(xiāng)、夕正習(xí)SN/T1396-2004月U呂本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)湖北出人境檢驗(yàn)檢疫局負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:陳建軍、郭明星、付文鵬、趙暉等。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出人

2、境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。SN/T1396-2004弓形蟲(chóng)病間接血凝試驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了弓形蟲(chóng)病的間接血凝(IHA)試驗(yàn)操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的檢疫、診斷及抗體水平的檢測(cè)。2材料和試劑2.196(12X8)孔1100V型血凝板及玻璃蓋板2.2可調(diào)式微量移液器及吸頭2.3平板振蕩器。2.4弓形蟲(chóng)IHA診斷液(抗原效價(jià))1:1024)，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清(效價(jià)<-1:4)，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清(效價(jià))1，1024)。2.5稀釋液按附錄A所示要求配制，所用試劑均為分析純。3采樣無(wú)菌采動(dòng)物靜脈血液約1mL-2mL，靜置自然析出血清或待血液凝固后以600g離心分離血清，56℃水浴滅活30min，預(yù)

3、冷，用健康公綿羊紅細(xì)胞(按血清/紅細(xì)胞體積比約1:1混勻)室溫吸附2h(或4℃冰箱過(guò)夜)，600g離心10min，取上清(要求無(wú)血球、無(wú)溶血、無(wú)雜菌污染)，置4℃冰箱備檢。4操作步驟4.1取潔凈的血凝板，于各孔中加入75IL稀釋液。4.2取受檢血清25fcL加人第一列孔中，用移液器反復(fù)吹吸混勻，取25pL加人第二列孔，混勻后取25pL加人第三列孔中，如此4倍稀釋至第6孔，混勻即1:4096棄去25pL(對(duì)于大量樣品可只稀釋至1，64見(jiàn)表1),表1弓形蟲(chóng)病間接血凝試驗(yàn)操作術(shù)式孔號(hào)1234567稀釋液空血清稀釋度0，)4166425610244096白對(duì)照稀釋液/uL;:};:};:}

4、::{;:{;:}47525受檢血清/“L診斷液/uL2525252525一2525感作220C-370C靜置2h^-3h結(jié)果舉例(樣)+十++十+++++4.3每次試驗(yàn)須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清及稀釋液空白對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照應(yīng)稀釋至1:4096，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照應(yīng)稀釋至1，64，標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清稀釋方法同受檢血清。4.4取弓形蟲(chóng)IHA診斷液(如為凍干制品需按使用說(shuō)明洗滌稀釋后使用)，于各檢驗(yàn)孔中加入25夙，置振蕩器上振蕩約1min(或手持血凝板繞圈輕搖至各孔中血球分布均勻)，蓋上玻璃蓋板，22'C-370CSN/T1396-2004靜置約2h-3h(當(dāng)稀釋液空白對(duì)照呈現(xiàn)“一”時(shí)

5、)觀(guān)察判定結(jié)果。5結(jié)果判定5.1判定方法a)100線(xiàn)的紅細(xì)胞在孔底四周呈均勻、致密的膜樣凝集，孔底中央無(wú)紅細(xì)胞沉積，記“++++”。b)75%的紅細(xì)胞在孔底四周呈膜樣凝集，有少量未凝集的紅細(xì)胞沉積在孔底中央呈很小的圓點(diǎn)，記“+++”。c)50%的紅細(xì)胞松散的凝集在孔底四周，其余50%未凝集的紅細(xì)胞沉積在孔底中央呈較大的圓點(diǎn)，記“++”。d)25%的紅細(xì)胞凝集在孔底四周，其余大部分未凝集的紅細(xì)胞沉積在孔底中央呈很大的圓點(diǎn)，記“+”。e)所有紅細(xì)胞均不凝集，全部沉積在孔底中央呈規(guī)則的最大的圓點(diǎn)，記“一”。5.2判定標(biāo)準(zhǔn)a)以呈現(xiàn)“++”的血清最大稀釋度為該血清的抗體滴度。b)當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清抗

6、體滴度不低于1:1024，陰性對(duì)照血清各孔均為“一”(第一孔允許存在前滯現(xiàn)象“+”)，稀釋液空白對(duì)照為“一”時(shí)，對(duì)受檢血清抗體滴度進(jìn)行判定，否則試驗(yàn)不成立。c)受檢血清抗體滴度)1，64時(shí)判為陽(yáng)性(如表1所示血清抗體滴度為1:64，判為陽(yáng)性)，(1，16判為陰性SN/T1396-2004附錄A(規(guī)范性附錄)稀釋液的配制A.1pH7.2,0.15mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS):磷酸氫二鈉(Na,HP0,·12H20)19.34g磷酸二氫鉀(KH,PO,)2.86g抓化鈉(NaCU4.25g疊氮化鈉(NaN,)1.00g雙蒸水(或去離子水)1000mL121'C,15min高壓滅菌。A.2

7、無(wú)菌取98mL上述PBS溶液，加人2mL經(jīng)560C30min滅活的健康兔血清，混勻，4℃下保藏備用。