正向間接血凝試驗

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1、正向間接血凝試驗省疫控中心周迎春主要內(nèi)容背景原理實驗器材的優(yōu)化試劑的優(yōu)化樣品的優(yōu)化實驗過程優(yōu)化判定標(biāo)準(zhǔn)注意問題一、背景正向間接血凝試驗(IHA)是上世紀(jì)60年代在我國發(fā)展起來的血清學(xué)診斷技術(shù)，是一種用已知抗原檢測未知抗體的試驗方法，它的操作方法相對簡單，實驗原理也易于理解，在基層實驗條件和技術(shù)相對落后的情況下經(jīng)常被應(yīng)用到，在一些動物疫病的免疫抗體檢測、疫病診斷上具有現(xiàn)實意義。林琳等研究表明應(yīng)用豬瘟正向間接血凝法(IHA)與斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）以及豬瘟抗體免凝金標(biāo)試紙條比較，對規(guī)?；B(yǎng)豬場138份不同階段豬血清進(jìn)行檢測，三種方法檢測抗體的

2、陽性率結(jié)果接近。一、背景數(shù)十年來正向間接血凝試驗技術(shù)不斷完善，它具有簡單、經(jīng)濟、快速、實用的特點，在我國有很大的用戶群，近年來，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的液體豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗的試劑用量在逐年加大。然而，正向間接血凝作為一種微量的定量反應(yīng)試驗，實驗結(jié)果受操作技術(shù)影響較大，任何操作環(huán)節(jié)的紕漏都會使最后判定的結(jié)果與正確結(jié)論大相徑庭。為規(guī)范操作，本次培訓(xùn)就實驗中器材、試劑、樣品、過程和判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的優(yōu)化做一綜述，以期作為此實驗的借鑒。二、原理正向間接血凝試驗的原理是將可溶性抗原吸附于與免疫無關(guān)的載體（紅細(xì)胞）表面，此吸附抗原的紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在有電解

3、質(zhì)存在的適宜條件下發(fā)生的肉眼可見的凝集性反應(yīng)。二、原理充分理解正向間接血凝試驗的原理，對整個試驗的操作和結(jié)果判定都具有很大的指導(dǎo)意義。三、實驗器材的優(yōu)化本實驗所使用的實驗器材包括微量血凝板，微量振蕩器，移液器和吸頭，為保證實驗的順利進(jìn)行，要選擇質(zhì)量有保障，穩(wěn)定性好的器材。三、實驗器材的優(yōu)化1、微量血凝板實驗室經(jīng)常使用的是有機玻璃材質(zhì)或者一次性的110°底角的96孔V型微量血凝板。有機玻璃板板可以疊放，不占實驗室臺面，處理樣品量較大時合適，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于37℃溫箱中烘干。用前要先

4、檢查血凝板孔底是否干凈，如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點的孔，可用酒精棉簽擦凈。除了有機玻璃板以外，還有一次性血凝板，不需清洗，也不用擔(dān)心板子不干凈影響結(jié)果，但不能疊放，測定少量樣品適合。三、實驗器材的優(yōu)化2、微量振蕩器使用振蕩器振蕩時間不宜超過10秒鐘，振蕩強度不能太大，先從小到大，中等強度即可。多塊板疊加后振蕩時要用手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果實驗室沒有它，也可用手輕拍血凝板的邊緣即可。三、實驗器材的優(yōu)化3、單、多道微量移液器建議使用高質(zhì)量的移液器，用定量移液器需要準(zhǔn)備50微升和25微升兩種。50微升的用來加稀釋液和稀釋

5、血清，25微升的用來加血凝抗原?？烧{(diào)的移液器要選擇與檢測過程中加樣量相近量程的移液器，吸取液體時動作要輕緩，防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造成堵塞漏氣。一定要養(yǎng)成移液器用完后放在移液器架上的習(xí)慣，移液器如果掉到地下很容易損壞。用完后移液器用75%的酒精棉擦拭，并把刻度調(diào)到最大值。三、實驗器材的優(yōu)化4、吸嘴高質(zhì)量的吸嘴經(jīng)過處理后可以重復(fù)使用。處理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超聲波清洗器處理10分鐘，換水后用二層紗布包好，用洗衣機甩干，再用超聲波清洗器處理10分鐘，再用洗衣機甩干，高壓消毒滅菌器中121℃，20分鐘即可，去蓋放37℃溫箱

6、中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗干凈，不必重復(fù)使用。接觸過高感染性材料的吸嘴要高溫消毒后廢棄。經(jīng)過處理后的吸嘴如果尖頭變彎，則質(zhì)量不好，不要重復(fù)使用。四、試劑的優(yōu)化1、抗原液體正向血凝抗原搖勻后呈咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團）的抗原建議不要使用。如果只做篩檢看是否達(dá)到合格線，一瓶抗原可以檢測30到50份血清。值得一提的是液體正向血凝抗原4~8℃保存，保存期3個月，不能冷凍保存。四、試劑的優(yōu)化2、對照血清陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血清微紅或淡黃色略微混濁

7、的液體。陰陽性對照血清可在-15℃到-20℃保存，有效期1年。3、稀釋液稀釋液無色透明，一般情況4~8℃保存。用前建議將稀釋液放室溫或37℃溫箱中半小時后搖勻再用較好。試劑不能放置太久，最好新進(jìn)現(xiàn)用。五、樣品血清的優(yōu)化新分離血清盡快檢測完，未檢血清-20℃保存。冷凍血清待檢時需融化，同時避免血清反復(fù)凍融影響檢測結(jié)果。嚴(yán)重溶血、嚴(yán)重污染、腐敗或有懸浮雜質(zhì)的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。六、實驗過程優(yōu)化正向血凝實驗過程包括：加稀釋液，稀釋待檢血清，稀釋陰性、陽性血清，加血凝抗原，震蕩靜置，結(jié)果判定。在試驗中要注意以下的問題：1、加稀釋液在血凝板上1~6

8、排的1~9孔；第7排的1~4孔，第6-7孔；第8排的