資源描述：
《功能性蛋白pEGF在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)與制備》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、全日制碩士專業(yè)學(xué)位（畢業(yè)）論文功能性蛋白pEGF在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)與制備學(xué)位申請(qǐng)人：董兵指導(dǎo)教師：檀建新教授學(xué)位名稱：工程碩士研究領(lǐng)域：食品工程授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一八年六月二日分類號(hào)：TS201.3單位代碼：10086密級(jí)：公開學(xué)號(hào)：20169070496功能性蛋白pEGF在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)與制備ExpressionandPreparationofFunctionalProteinpEGFinBacillusBubtilis學(xué)位申請(qǐng)人：董兵指導(dǎo)教師：檀建新教授學(xué)位名稱：工程碩士研究領(lǐng)域：食品工程授予
2、單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一八年六月二日摘要枯草芽孢桿菌是食品加工用酶制劑的主要生產(chǎn)菌種，也是某些功能性食品的發(fā)酵菌種，因此，它已成為食品基因工程中研究最為廣泛的菌種之一，針對(duì)其構(gòu)建的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)可高效表達(dá)多種外源性食品中常用酶和蛋白質(zhì)。在表達(dá)系統(tǒng)中，載體是外源蛋白能否成功表達(dá)的必要且關(guān)鍵因素，因此，構(gòu)建一套結(jié)構(gòu)完整、功能多樣的表達(dá)載體，可為外源酶或功能蛋白在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)提供新素材。豬肉食品中抗生素物質(zhì)大量殘留，威脅人類健康。功能性蛋白pEGF具備較好的促生長功能和生物安全性，在抗生素替代物研究方面具
3、備很大的潛力，但是其提取純化困難，產(chǎn)量低，限制了其規(guī)模化的生產(chǎn)。利用食品基因工程技術(shù)，通過枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)pEGF的外源高效表達(dá)，并進(jìn)行初步發(fā)酵條件摸索，可為其規(guī)?；a(chǎn)打下基礎(chǔ)。本試驗(yàn)構(gòu)建了一套用于B.subtilis的載體，并對(duì)其性能進(jìn)行檢驗(yàn)，然后將該載體應(yīng)用于pEGF蛋白的外源表達(dá)，內(nèi)容如下：1.以穿梭載體pDG150為基礎(chǔ)，通過重組改造構(gòu)建了B.subtilis的系列載體，并驗(yàn)證了它們的表達(dá)能力和穩(wěn)定性。其中，pTD160為基礎(chǔ)載體，pTD161為表達(dá)載體，pTD162為表面展示載體。將lipa基因?qū)肷鲜鰌
4、TD系列載體，轉(zhuǎn)化B.subtilis168中表達(dá)，利用RashidNp-NPP比色法檢測(cè)其lipA酶活性為23.4U/mg和15.31U/mg，表明載體能高效表達(dá)lipA蛋白。通過無抗生素壓力傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)10代后發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性仍為96.5％和95%，證明構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒具備較高的穩(wěn)定性。2.將功能性蛋白pEGF的基因pegf按大腸桿菌密碼子優(yōu)化后合成，分別導(dǎo)入pTD161和pTD162，轉(zhuǎn)化B.subtilis，檢測(cè)其表達(dá)量，并優(yōu)化其誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。ELISA法檢測(cè)Bs168-pTD162-pegf中pEGF蛋白表達(dá)量可達(dá)
5、365ng/mL，Bs168-pTD162-pegf芽孢的蛋白表達(dá)量為285ng/mL，證明其得到表達(dá)。同時(shí)，對(duì)其誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的表達(dá)量提高到380ng/mL。3.將pegf導(dǎo)入pET21b，并轉(zhuǎn)化BL21，誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)其表達(dá)量為783ng/mL，然后對(duì)pEGF進(jìn)行初步分離純化，其純化后可蛋白量達(dá)723ng/mL。4.將pEGF和GFP融合表達(dá)，之后導(dǎo)入pTD161和pTD162并轉(zhuǎn)化B.subtilis168，檢測(cè)其熒光信號(hào)和融合蛋白表達(dá)量。通過融合PCR獲得pEGF和GFP融合蛋白基因pegf-gfp。將
6、其導(dǎo)入pTD161轉(zhuǎn)化B.subtilis168，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，ELISA檢測(cè)pEGF蛋白表達(dá)量為358ng/mL，并通過熒光顯微鏡檢測(cè)可見熒光信號(hào)，表明pEGF-GFP獲得表達(dá)。將融合基因pegf-gfp導(dǎo)入pTD162，轉(zhuǎn)化B.subtilis168，用DSM培養(yǎng)基收集芽孢，檢測(cè)pEGF蛋白表達(dá)量為268ng/mL，用熒光顯微鏡檢測(cè)其熒光信號(hào)，證明pEGF-GFP獲得表達(dá)。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；穿梭表達(dá)載體；表面展示載體；pEGF；pEGF-GFPExpressionandPreparationofFunctiona
7、lProteinpEGFinBacillusBubtilisName:DongBingMajor:FoodEngineeringSupervisor:TanJianxinAbstractBacillussubtilisisthemainproducerofenzymepreparationsforfoodprocessing,anditisalsoafermentativestrainofcertainfunctionalfoods.Therefore,ithasbecomeoneofthemostwidelystudied
8、strainsinfoodgeneticengineering.TheBacillussubtilisexpressionsystemconstructedforitcanefficientlyexpressavarietyofenzymesandproteinscommonlyusedi
