大薊總黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究

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1、大薊總黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究作者：劉素君，郭紅，潘明，楊志榮，張杰【摘要】　　目的研究大薊總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。方法用不同濃度的大薊總黃酮對(duì)人肝癌SMMC-7721和人子宮癌細(xì)胞Hela進(jìn)行處理，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，再用瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA“梯子”(Ladder)和DAPI染色觀察凋亡小體。結(jié)果大薊總黃酮對(duì)SMMC-7721的半數(shù)致死量(IC50)為μg/ml；對(duì)Hela細(xì)胞的半數(shù)致死量(IC50)為μg/ml。可見(jiàn)清晰的“梯子”狀DNA帶紋和凋亡小體。結(jié)論大薊總黃酮能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的作用?！娟P(guān)鍵詞】大薊　總黃酮　抗腫瘤　細(xì)胞凋亡　大薊為菊科管狀花亞

2、科菜薊族薊屬植物CirsiumjaponicumDC.的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高100～150cm，莖直立，密被白毛，葉互生；葉片倒卵狀長(zhǎng)橢圓形，邊緣具淺裂和斜刺，被毛；5～6月開(kāi)花，頭狀花序頂生，花單生，紫紅色，瘦果扁橢圓形，生于山野路邊，以全草和根入藥，我國(guó)大部分地區(qū)有分布。全草灰綠色，大薊性涼，味甘、苦,歸心、肝經(jīng)，功效為涼血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、帶下、腸風(fēng)、腸癰、癰瘍腫毒、疔瘡、高血壓及肝炎等。其化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮、黃酮苷，揮發(fā)油、三萜和甾醇等物質(zhì)。大薊在民間驗(yàn)方多用于治療癌癥，如：大薊根、三白草根治肝癌；鮮大薊葉與雞蛋清攪拌后貼

3、于患處，可治乳腺癌等。大薊的主要成分為黃酮類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道其多聚乙炔具有抗腫瘤作用［2］。其總黃酮在體內(nèi)有抗腫瘤作用并能提高腫瘤小鼠的免疫功能［3］。但總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用還沒(méi)有研究，本文就其對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用進(jìn)行初步探索?！?材料與儀器瘤株SMMC-7721和Hela細(xì)胞株，購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。藥物：大薊由成都中藥材公司提供。試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)為GIBCO公司產(chǎn)品，染料碘化丙啶(PI)、胰蛋白酶均為Sigma公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司。儀器酶標(biāo)儀，離心機(jī)，倒置顯微鏡。大薊總黃酮的制備大薊總黃酮由本室

4、制備。將大薊70%乙醇提取物與硅藻土拌樣揮干后,裝入玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的葉綠素和極性較小的成分;流洗結(jié)束后倒出硅藻土化合物,揮干溶劑重新裝入玻璃管柱,正丁醇流洗提取,用1%三氯化鋁乙醇溶液與黃酮類化合物在濾紙上顯色后，在紫外燈下觀察有無(wú)黃綠色熒光的方法檢測(cè)監(jiān)控,提取至流洗液無(wú)黃酮反應(yīng)時(shí)結(jié)束;將正丁醇提取液濃縮后揮干溶劑,用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺樹(shù)脂柱,依次用水和95%的乙醇洗脫,收集95%的乙醇洗脫液,洗脫至檢測(cè)無(wú)黃酮反應(yīng)時(shí)結(jié)束;濃縮95%的乙醇洗脫液,自然干燥,揮干溶劑后得到的成分即為總黃酮成分。紫外分光光度測(cè)定其總黃酮為%?？傸S酮用DMSO溶解?！?方法.1M

5、TT法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的作用SMMC-7721和Hela細(xì)胞株用%胰蛋白酶化后，懸浮于含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，用玻璃滴管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。取少許細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大97%，將細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔190μl(含1×104個(gè)細(xì)胞),2h后，分別加入陰性對(duì)照磷酸鹽緩沖液(PBS)、陽(yáng)性對(duì)照以及～200μg/mg不同濃度的大薊黃酮提取液各10μl,3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7h,然后每孔加入10μlmg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)h，仔細(xì)吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜150μl。1h后，在570nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀

6、測(cè)OD值。重復(fù)3次并計(jì)算抑制率。抑制率(IC)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。.2DAPI染色的染色體DNA的形態(tài)分別收集大薊總黃酮處理細(xì)胞和未用藥的細(xì)胞用定色劑染色10min，10min后用PBS沖洗，細(xì)胞再用DAPI液，然后用固定液固定，染色體DNA的形態(tài)在熒光顯微鏡下觀察。．3DNA瓊脂糖凝膠電泳分別收集大薊總黃酮和順鉑處理細(xì)胞1×10個(gè)，按酚、氯仿、異戊醇抽提，乙醇沉淀等常規(guī)方法提取細(xì)胞總DNA，2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀上觀察DNA條帶?！?結(jié)果.1MTT法測(cè)試結(jié)果用劑量～200μg/mg的大薊總黃酮處理SMMC-7721和Hela細(xì)胞48h后，M

7、TT法測(cè)定大薊黃酮對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。從圖1可以看到，對(duì)SMMC-7721和Hela細(xì)胞的IC50分別為μg/ml和μg/ml，同空白對(duì)照組比較差異極顯著。當(dāng)用劑量～200μg/mg的大薊黃酮處理SMMC-7721和Hela細(xì)胞1，d或d后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從圖2可以看到，活細(xì)胞數(shù)隨著大薊黃酮濃度的增加而減少。研究結(jié)果表明大薊黃酮對(duì)SMMC-7721和Hela細(xì)胞的抑制呈劑量和時(shí)間依賴性。用大薊黃酮處理時(shí)間越長(zhǎng)或劑量越大，對(duì)腫瘤細(xì)