大薊總黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究

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1、大薊總黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究作者：劉素君，郭紅，潘明，楊志榮，張杰【摘要】　　目的研究大薊總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。方法用不同濃度的大薊總黃酮對(duì)人肝癌SMMC-7721和人子宮癌細(xì)胞Hela進(jìn)行處理，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，再用瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA“梯子”(Ladder)和DAPI染色觀察凋亡小體。結(jié)果大薊總黃酮對(duì)SMMC-7721的半數(shù)致死量(IC50)為93.64μg/ml；對(duì)Hela細(xì)胞的半數(shù)致死量(IC50)為85.12μg/ml。可見清晰的“梯子”狀DNA帶紋和凋亡小體。結(jié)論大薊總黃酮能誘導(dǎo)

2、癌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的作用?！娟P(guān)鍵詞】大薊　總黃酮　抗腫瘤　細(xì)胞凋亡　大薊為菊科管狀花亞科菜薊族薊屬植物CirsiumjaponicumDC.的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高100～150cm，莖直立，密被白毛，葉互生；葉片倒卵狀長(zhǎng)橢圓形，邊緣具淺裂和斜刺，被毛；5～6月開花，頭狀花序頂生，花單生，紫紅色，瘦果扁橢圓形，生于山野路邊，以全草和根入藥，我國(guó)大部分地區(qū)有分布。全草灰綠色，大薊性涼，味甘、苦,歸心、肝經(jīng)，功效為涼血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、帶下、腸風(fēng)、腸癰、癰瘍腫

3、毒、疔瘡、高血壓及肝炎等。其化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮、黃酮苷，揮發(fā)油、三萜和甾醇等物質(zhì)。大薊在民間驗(yàn)方多用于治療癌癥，如：大薊根、三白草根治肝癌；鮮大薊葉與雞蛋清攪拌后貼于患處，可治乳腺癌等。大薊的主要成分為黃酮類化合物，　　3結(jié)果　　3.1MTT法測(cè)試結(jié)果用劑量12.5～200μg/mg的大薊總黃酮處理SMMC-7721和Hela細(xì)胞48h后，MTT法測(cè)定大薊黃酮對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用（見圖1）。從圖1可以看到，對(duì)SMMC-7721和Hela細(xì)胞的IC50分別為93.64μg/ml和85.12μg/ml，同空白對(duì)

4、照組比較差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)用劑量12.5～200μg/mg的大薊黃酮處理SMMC-7721和Hela細(xì)胞1，2d或3d后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)（見圖2），從圖2可以看到，活細(xì)胞數(shù)隨著大薊黃酮濃度的增加而減少。研究結(jié)果表明大薊黃酮對(duì)SMMC-7721和Hela細(xì)胞的抑制呈劑量和時(shí)間依賴性。用大薊黃酮處理時(shí)間越長(zhǎng)或劑量越大，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果就越明顯。　　3.2瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，從DNA電泳圖（圖3）上可以看到，癌細(xì)胞經(jīng)100μl/ml的大薊總黃酮處理培養(yǎng)72h后，出現(xiàn)大小約

5、為180～200bp整數(shù)倍的DNA梯形斷裂條帶，而空白對(duì)照組細(xì)胞DNA提取物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后只檢測(cè)到一條總DNA條帶。Hela細(xì)胞用100μl/ml的大薊黃酮處理培養(yǎng)72h后，出現(xiàn)大小約為180～200bp整數(shù)倍的DNA梯形斷裂條帶(圖3-A)。lane3為陽(yáng)性對(duì)照（Hela細(xì)胞用0.1μMtaxol處理4h(圖3-A)。圖3大薊總黃酮對(duì)SMMC的電泳圖。癌細(xì)胞經(jīng)100μl/ml的大薊總黃酮處理培養(yǎng)72h后，同樣出現(xiàn)大小約為180-200bp整數(shù)倍的DNA梯形斷裂條帶(圖3-B，lane4).研究結(jié)果表明大薊黃

6、酮能誘導(dǎo)SMMC-7721和Hela細(xì)胞凋亡?！　?.3DAPI染色觀察腫瘤細(xì)胞凋亡的特征凋亡的另一個(gè)特征是用DAPI染色觀察染色體DNA的形態(tài)，圖4(A)為未處理的Hela細(xì)胞染色體DNA，圖4(B)是用大薊總黃酮100μl/ml處理24h后的Hela細(xì)胞染色體DNA。Hela細(xì)胞在空白對(duì)照中出現(xiàn)分散的染色體DNA，圖3(A)，而用藥物處理后Hela細(xì)胞的染色體DNA明顯的隨處理時(shí)間而改變，24h后,染色體DNA在核膜附近濃縮成一個(gè)或幾個(gè)明顯的小體，圖4(B)。圖4(C～D)為處理和未被處理的SMMC細(xì)胞染色體

7、DNA形態(tài)的變化，其凋亡特征也能觀察到。　　4討論細(xì)胞凋亡是人體保持某一細(xì)胞群生存與死亡平衡的生理機(jī)制。它參與調(diào)節(jié)機(jī)體的發(fā)育、細(xì)胞的分化,體內(nèi)正常細(xì)胞的更新和異常細(xì)胞的清除。普遍認(rèn)為它與分裂、細(xì)胞分化類似，是一個(gè)級(jí)連式(Cascade)基因表達(dá)的結(jié)果,受許多因素的調(diào)控［4］。如果這一調(diào)控發(fā)生異常則會(huì)導(dǎo)致包括腫瘤、自身免疫病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及AIDS等許多疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的典型特征是:細(xì)胞凋亡過程中,被激活的核酸內(nèi)切酶可有規(guī)律地將凋亡細(xì)胞DNA在兩核小體間切斷,DNA凝膠電泳時(shí)形成了特征性的DNA階梯。形態(tài)上則

8、表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮為不均一點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的另一顯著特征是凋亡過程中交聯(lián)細(xì)胞蛋白酶(transglutaminant)等的信號(hào)途徑被激活,致使細(xì)胞漿濃縮形成的具有完整細(xì)胞膜包裹的凋亡小體(Apobody),電鏡下,表現(xiàn)為凋亡發(fā)生早期,凋亡小體內(nèi)含有正常形態(tài)的線粒體等細(xì)胞器［5］。大薊總黃酮能誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和人子宮癌Hela細(xì)胞的凋亡，通過MTT法檢測(cè)，其