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1、CTAB—硅珠法提取DNA實(shí)驗(yàn)流程前言:實(shí)驗(yàn)是要求非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪^程,每個(gè)一步驟都可能對后面的操作產(chǎn)生很大影響,乃至影響后面的結(jié)果.一步錯(cuò),步步錯(cuò),每一個(gè)操作的失誤都可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗.事實(shí)求是與踏踏實(shí)實(shí)的作風(fēng)是每個(gè)做實(shí)驗(yàn)的人必備的基本品質(zhì).永遠(yuǎn)記住,任何弄虛作假的行為都是可恥的.在這個(gè)充滿學(xué)術(shù)腐敗的科學(xué)界,保持自己的純真.????????????????????謹(jǐn)記1.材料的采集采取植物的嫩葉,可以用硅膠干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止葉片組織的降解及葉片的褐化.用泡沫塑料箱子帶回,置于-70℃冰箱保存.2.CTAB—硅珠法提取DNA實(shí)驗(yàn)流程各加入液體的配制：1、CTA
2、B提取液：2%（W/Vg/mol）CTAB；5%（W/Vg/mol）PVP；1.4mol/lNaCl；20mmol/LEDTAPH=8.0；l00mmol/lTris-HClPH=8.0；?2%(V/V)巰基乙醇(臨時(shí)加入)配制量：500ml配制方法：(1)計(jì)算所需組分量CTAB???????10g??需熱磁力攪拌PVP???????25g??NaCl???????40.908g??EDTA.Na2.2H2O????3.7224g??調(diào)PH=8冷卻為常溫時(shí)(母液)Tris???????6.057g??(2)稱取CTAB10g，NaCl40.908g，PVP25g置于500m
3、l燒杯中(3)加入約300ddH2O(雙蒸水)充分磁力攪拌溶解(注意：EDTA和PVP較難溶，加熱溶解的同時(shí)用熱磁力攪拌直至完全的透明為止)(4)量取20mlEDTA(0.5mol/lPH=8)，50mlTris-HCl(1mol/lPH=8)溶液于燒杯中，均勻混合(5)將燒杯溶液定容至500ml后，高溫高壓滅菌(6)室溫保存。0.5mol/LEDTA配制組分濃度：0.5mol/lEDTA，PH=8配制量：500ml配制方法(1)稱取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500ml燒杯中??(2)加入約400mlddH2O.用熱磁力攪拌器充分?jǐn)嚢??(3)用NaOH調(diào)
4、節(jié)PH值到8，約用10克固體NaOH??(4)在溶液冷卻后，再用NaOH調(diào)節(jié)至PH=8??(5)加ddH2O將溶液定容到500ml??(6)高溫高壓滅菌后，室溫保存NaOH溶液的配制組分濃度：5mol/lNaOH配制量：100ml配制方法(1)稱取固體NaOH20克于容器中(2)加入ddH2O定容到100ml100mmol/lTris-HCl的配制組分濃度：mmol/lTris-HCl，PH=6.4配制量：250ml配制方法(1)稱取3.025克Tris于250ml燒杯中.?(2)加入約200mlddH2O充分?jǐn)嚢枞芙??(3)用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值到6.4.所用濃鹽酸約3ml
5、?(4)將溶液定容至250ml?(5)用棕色瓶分裝于4度冰箱中?(6)如使用，用水浴加熱溶解.2、氯仿-異戊醇的配制：配制方法(1)簡單的體積混合，既要求比例為24：1即可??(2)儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶子中??(3)置于4度冰箱以便日后使用3總的實(shí)驗(yàn)流程3.1．總的DNA的提?。?.??在10ml離心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巰基乙醇，在65℃水浴鍋中預(yù)熱2.??取材料1-2g于研缽中，加入適量液氮迅速多次研磨成細(xì)粉狀，轉(zhuǎn)至預(yù)熱的CTAB提取液中，用封口膜將離心管封密以防止巰基乙醇揮發(fā).放回水浴中保溫30分鐘，保溫過程中輕晃幾次，保持搖勻.3
6、.??取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷卻到室溫，加入等體積的4ml氯仿-異戊醇（24：1），輕微混合均勻且充分，使其徹底地混合成乳狀液，然后4℃下離心12000rpm10min，輕輕將上清液吸取1ml于1.5ml離心管，放于-20℃冰箱中備用.各加入液的用途：（1）去污劑：CTAB：可將細(xì)胞膜裂解，使DNA釋放到提取液中，同時(shí)也使組織勻漿中的蛋白質(zhì)變性.EDTA：能與DNase的輔助因子Mg2+結(jié)合，使DNase失去活性，不能降解從細(xì)胞中釋放的DNA.（2）還原劑巰基乙醇：它抑制從細(xì)胞中釋放的多酚氧仿.防止植物組織發(fā)黃變褐.（3）氯仿—異戊醇：它可把組織勻漿中變性
7、的蛋白質(zhì)除去，將DNA與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等分開除去.（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.3.2．總DNA的純化操作步驟：1.??取出1.5ml離心管，內(nèi)含所取DNA，加入100ul硅珠懸浮液（此液要求先行渦旋再使用），使用渦旋振蕩器大約15s，使之充分混勻，于室溫靜置10分鐘，再振蕩5秒，后離心：8000rpm15s4度，去除上清液得到硅珠——核酸復(fù)合物.2.??將復(fù)合物用鑷子一次打兩個(gè)，打成液狀，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再渦旋充分混勻，后離心8000rpm15s棄掉上清液.3
