ctab--硅珠法提取dna實(shí)驗(yàn)操作

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1、前言:實(shí)驗(yàn)足要求殊纟產(chǎn)後的過程，每個(gè)一步驟都可滋對后曲的操作產(chǎn)唆很丈影響，73至彫響后面的豬果，一步籍，步步籍，每一個(gè)燥作的失誤都可飩導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失氏事實(shí)朮是鳥臘緒實(shí)實(shí)的作風(fēng)是每個(gè)做實(shí)臉的人必備翁屋涼品質(zhì)，永迄杞住，代何弄疾作假的行簽都足可恥的，在運(yùn)個(gè)充滿禽術(shù)扁畋的科禽界?保持自己的絶命謹(jǐn)記1?材料的采集釆取植物的嫩葉,可以用硅膠干燥保存，也可以用冰袋,主要是防止葉片組織的降解及葉片的褐化.用泡沫塑料箱子帶回，置于-70°C冰箱保存.2.CTAB—硅珠凍提取DNA賣殮流程各加入液體的配制：1、CTAB提取液：2%(W/Vg/mol)CTAB；5%(W/Vg/mol)PV

2、P：1.4mol/lNaCl；20mmol/LEDTAPH=8.()；100mmol/lTris-HClPH=8.0；2%(V/V)藐基乙醇(臨吋加入)配制量：500ml配制方法：(1)計(jì)算所需組分量CTAB10g需熱磁力攪拌PVP25gNaCl40.908gEDTA.Na2.2H2O3.7224g調(diào)PH=8冷卻為常溫時(shí)(母液)Tris6.057g(2)稱取CTAB10g,NaCl40.908g,PVP25g置于500ml燒杯中⑶加入約300dd出0(雙蒸水)充分磁力攪拌溶解(注意：EDTA和PVP較難溶，加熱溶解的同時(shí)用熱磁力攪拌直至完全的透明為止)(4)量取20mlE

3、DTA(0.5mol/lPH=8),50mlTris-HCl(lmol/1PH=8)溶液于燒杯中，均勻混合(5)將燒杯溶液定容至500ml后，高溫高壓滅菌(6)室溫保存。0.5mol/LEDTA配制組分濃度：O.5mol/1EDTA,PH=8配制量：500ml配制方法(1)稱取93.06克EDTA.Na2.2H2O,置于500ml燒杯中(2)加入約400mldd出0.用熱磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?2)用NaOH調(diào)節(jié)PH值到8,約用10克固體NaOH(3)在溶液冷卻后，再用NaOH調(diào)節(jié)至PH=8(4)加ddH2O將溶液定容到500ml(5)imj溫咼壓滅菌后，室溫保存NaOH溶液

4、的配制組分濃度：5mol/1NaOH配制量：100ml配制方法(1)稱取固體NaOH20克于容器中(2)加入ddH2O定容到100ml100mmol/1Tris-HCl的配制組分濃度：mmol/1Tris-HCl,PH=6.4配制量：250ml配制方法⑴稱取3.025克Tris于250ml燒杯中.(2)加入約200mlddH2O充分?jǐn)嚢枞芙?(3)用濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值到6.4.所用濃鹽酸約3ml(4)將溶液定容至250ml(5)用棕色瓶分裝于4度冰箱中(6)如使用，用水浴加熱溶解.2、氯仿?異戊醇的配制：配制方法(1)簡單的體積混合，既要求比例為24：1即可(2)儲存于棕色

5、玻璃瓶子中(3)置于4度冰箱以便口后使用3總的賣殮流程3」.總的DNA的提?。?.在10ml離心管(eppendorf管)中加入4mlCTAB提取液及80ul基乙醇，在65°C水浴鍋中預(yù)熱2.取材料1-2g于研缽中，加入適量液氮迅速多次研磨成細(xì)粉狀，轉(zhuǎn)至預(yù)熱的CTAB提取液中，用封口膜將離心管封密以防止疏基乙醇揮發(fā)?放回水浴屮保溫30分鐘，保溫過程屮輕晃兒次，保持搖勻.3.取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷卻到室溫，加入等體積的4ml氯仿-異戊醇(24：1),輕微混合均勻且充分，使其徹底地混合成乳狀液，然后4°C下離心12000rpmlOmin,輕輕將上清液吸取l

6、ml于1.5ml離心管,放于-20°C冰箱中備用.各加入液的用途：(1)去污劑：CTAB：可將細(xì)胞膜裂解，使DNA釋放到提取液中，同吋也使組織勻漿中的蛋白質(zhì)變性.EDTA：能與DNase的輔助因子結(jié)合，使DNase失去活性，不能降解從細(xì)胞中釋放的DMA.(2)還原劑疏基乙醇：它抑制從細(xì)胞屮釋放的多酚氧仿.防止植物組織發(fā)黃變褐.(3)氯仿一異戊醇：它可把組織勻漿屮變性的蛋白質(zhì)除去，將D7A與細(xì)胞屮的蛋白質(zhì)、碳水化合物等分開除去.(4)RNase：它可去除核酸中的RNA,只留下DNA.3.2.總DNA的純化操作步驟：1.取出1.5ml離心管，內(nèi)含所取DNA,加入lOOul硅珠

7、懸浮液(此液要求先行渦旋再使用)，使用渦旋振蕩器大約15s,使之充分混勻，于室溫靜置10分鐘，再振蕩5秒，后離心：8000rpm15s4度，去除上清液得到硅珠一一核酸復(fù)合物.2.將復(fù)合物用鍛子一次打兩個(gè)，打成液狀，使之完全分散，加入漂洗液lml,再渦旋充分混勻，后離心8000rpm15s棄掉上清液.3.重復(fù)上一步一次.4.用70%的lml乙醇將硅珠一一核酸復(fù)合物漂洗兩次.每次渦旋充分混勻后，離心8000rpm15s,棄上清液，打散，最后用lml無水乙醇再漂洗一次，用渦旋混勻離心8000rpm15s,然后將離心管管口打開倒置在吸