蛋白質的wesrern印跡分析

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1、蛋白質的Western印跡分析劉二戰(zhàn)一、原理一個基因表達的最終產(chǎn)物是產(chǎn)生相應的蛋白，因此檢測蛋白是測定基因表達的主要標志。原理：WesternBlotting是將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離；并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜進行雜交，使其與膜上的靶蛋白特異性結合；再與經(jīng)辣根過氧化物酶標記的二抗結合，最后用ECL試劑反應，經(jīng)X線片曝光、顯影等一系列反應，檢測蛋白質等生物大分子。二、方法樣品蛋白的制備SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳轉膜檢測三、樣品蛋白的制備1、原理：蛋白質的制備工作涉及物理

2、、化學和生物等各方面知識，但基本原理只有兩個方面：一是用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使備組分分配于不同區(qū)域而達到分離目的，如電泳、超速離心、超濾等。三、樣品蛋白的制備2、蛋白質制備的步驟（1）選擇材料和預處理（2）細胞的破碎及細胞的分離（3）提取和純化（4）濃縮、干燥和保存三、樣品蛋白的制備3、培養(yǎng)細胞中蛋白質樣品的提取提取細胞蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質釋放的原理，在提取蛋白質的實驗中要考慮到細胞裂解液的pH、去污劑的類型和濃度，以及二價陽離子、輔助

3、因子等因素，同時為防止細胞內(nèi)蛋白酶對蛋白質的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制劑。三、樣品蛋白的制備3.1實驗材料（1）器材：冷凍離心機，細胞刮，Tip頭、1.5ml、0.5ml滅菌Ep管，碎冰。（2）試劑：①細胞總蛋白裂解液（100ml）:1×PBS80ml，Triton-1001ml,去氧膽酸鈉0.5g,SDS0.1g,補1×PBS緩沖液至100ml。②PMSF貯存液（PMSF17.4mg/異丙醇）：PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不穩(wěn)定，應在臨用前向不含PMSF的裂解緩沖液中加入PMSF貯存液100ul,使其終濃度為0.174mg/ml。（3）Hela細胞三、樣品蛋白的制備3.2實驗方

4、法（1）洗滌細胞：選取細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的Hela細胞，由37℃取出后放入冰盤中，預冷。吸棄原培養(yǎng)液，用4℃預冷的1×PBS洗細胞表面3～4次，除凈培養(yǎng)基中的血清，并盡量吸棄細胞培養(yǎng)皿中殘余的PBS。（2）向培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，輕輕晃動，使裂解液均勻鋪于細胞表面。（3）冰浴30～60min，期間晃動3～4次。（4）用細胞刮子集中裂解液，收集入冰上預冷的1.5mlEp管中，4℃離心，12000g20min.（5）小心吸取上清液入新的預冷管中（為避免反復凍融導致蛋白降解，可按需要將其分裝使用），-80℃保有存?zhèn)溆茫杀４?年）三、樣品蛋白的制備3.3注意事項（1）注意個

5、人防護：PMSF嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進或通過皮膚吸收有致命危險。一旦眼晴或皮膚接觸了PMSF，立即用大量清水沖洗。（2）設立必要實驗對照。（3）為防止蛋白降解，上述操作全部應在冰上完成。（4）所用離心機需要提前預冷。（5）可于顯微鏡下觀察細胸裂解的程度。（6）吸取蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來。三、樣品蛋白的制備4、蛋白質的濃度測定——考馬斯亮藍蛋白定量法考馬斯亮藍G－250法是比色法與色素法相結合的復合方法，簡便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。4.1原理考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌鞍踪|

6、-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。三、樣品蛋白的制備4.2實驗材料（1）器材：分光光度計及玻璃比色皿（2）試劑：①0.5%mg/mlBSA標準蛋白液：生理鹽水配制，分裝小管，4℃保存。②考馬斯亮藍G-250母液：稱取考馬斯亮藍G-250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml濃磷酸(W/V)。過濾，4℃保存6個月。③考馬斯亮藍G-250使用液（0.01%考馬斯亮藍G-250）：取考馬斯亮藍G-250母液1

7、5ml，加蒸餾水稀釋至85ml，臨用前稀釋。三、樣品蛋白的制備4.3實驗方法（1）稀釋BSA標準品及制作標準曲線：用生理鹽水將0.5mg/ml牛血清白蛋白（BSA）標準蛋白液稀釋成0,1,2,4,8,10,12ug/100ul（2）上述每管中分別加入1.5ml考馬斯亮藍G-250使用液，室溫反應后測定595nm吸光度值(OD595)，依據(jù)所得數(shù)據(jù)制作標準曲線。（3）稀釋待測蛋白樣品：吸取細胞總蛋白樣品2ul，