流感病毒鑒定課件

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1、流感病毒的鑒定福建省衛(wèi)生防疫站楊式芹一、原理流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)。流感病毒的受體為含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，許多哺乳類動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均有此兩種成分，因此，它們均能被流感病毒所識(shí)別和結(jié)合，并發(fā)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。于病毒懸液中加入特異性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。流感病毒雖然能凝集多種哺乳類和禽類的紅細(xì)胞，但應(yīng)用最廣泛的為豚鼠、雞和人“O”型的紅細(xì)胞。二、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)及其抑制試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集及其抑制試驗(yàn)按其容量多寡分

2、為兩大類：1）常量法：總?cè)萘繛?.75ml2）微量法：總?cè)萘繛槌Ａ糠ǖ?/10國內(nèi)把紅細(xì)胞凝集抑制（HI）測定分為三種：1）常規(guī)法2）半加敏法3）加敏法1.材料：標(biāo)準(zhǔn)參照血清即國家流感中心最新公布的甲3（H3N2），甲1（H1N1）和乙型病毒的免疫血清。標(biāo)準(zhǔn)參照抗原即國家流感中心最新公布的H3N2，H1N1和乙型的病毒抗原。質(zhì)量可靠的受體破壞酶（RDE）。配制好的1%雞或豚鼠或人的紅細(xì)胞。0.85%NaCl。干凈的大孔塑料板。10ml和1ml吸管或稀釋器。試管、三角瓶、試管架，筆。消毒缸、冰盤、37℃和56℃水浴箱。待

3、鑒定病毒。2.操作步驟1）RDE處理標(biāo)準(zhǔn)參照血清2）四個(gè)單位抗原的配制3）紅細(xì)胞凝集滴度計(jì)算（見表1）4)四個(gè)血凝單位復(fù)核測定5）紅細(xì)胞凝集抑制測定（見表2）6）觀察結(jié)果：一層紅細(xì)胞均勻地鋪于孔壁上者為++++。基本同上，但邊緣不整齊，鋪的面積稍小些者為+++。紅細(xì)胞形成一個(gè)環(huán)狀，四周有小凝集塊者為++。紅細(xì)胞形成一個(gè)小團(tuán)，但邊緣不光滑，四周有小凝塊者為+。如用雞紅細(xì)胞于孔底形成一個(gè)小團(tuán)，邊緣光滑有立體感，將板傾斜片刻，就可見紅細(xì)胞滑動(dòng)像人的眼淚樣為-。如用豚鼠或人紅細(xì)胞形成一個(gè)小圓圈，邊緣光滑無任何小凝集者為-。“±

4、”即為可疑，計(jì)算時(shí)以“-”（陰性）處理。計(jì)算時(shí)請參考以下口訣：①先整后算。表1中，1-4，6和7不必進(jìn)行整理，而5中，必須將1:640處一個(gè)加號(hào)挪到1:320處，使1:320處為4個(gè)加號(hào)，而1:640處變成兩個(gè)加號(hào)，然后再進(jìn)行計(jì)算。②兩個(gè)加號(hào)不用算。如表1中3，其滴度為640。③小，小本身的1/8。如表1中2，1:640處僅一個(gè)加號(hào)，故其血凝滴度一定少于640，計(jì)算之：640-640/8=560。④大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，計(jì)算之：640+640/4=800。⑤兩個(gè)極端取中間（均數(shù)）。如表1中

5、1，1:320時(shí)4個(gè)加號(hào)，而1:640時(shí)陰性，計(jì)算之：320+640/2=480。表中6結(jié)果表明，血凝滴度未抓住，它必然大于1280，也可能成≥1920。因1:1280的高一個(gè)稀釋度為1:2560，1:2560時(shí)可能出現(xiàn)的結(jié)果應(yīng)從“–”至“++++”，當(dāng)“–”時(shí)，滴度為1920，其余情況下均大于1920。當(dāng)然要想知道精確的滴度應(yīng)重新滴定，直至終點(diǎn)抓住為止。7中是否有血凝滴度？不清楚，其血凝滴度肯定<10，同理1:5處可能出現(xiàn)–～++++。當(dāng)出現(xiàn)++++時(shí)，血凝滴度應(yīng)為7.5，其余情況下均小于7.5。四個(gè)血凝單位計(jì)算：將

6、血凝單位除以4，表1中1它的四個(gè)血凝單位應(yīng)為：480/4=120，即將標(biāo)本1進(jìn)行1:120稀釋時(shí)，其稀釋液就是含四個(gè)血凝單位。請注意！1:120稀釋應(yīng)為1ml病毒懸液加119ml稀釋液（一般為生理鹽水）。同樣計(jì)算之前，有些結(jié)果必須進(jìn)行整理，如6中，必須把1︰320處一個(gè)加號(hào)挪到1︰640處，使1︰320處變成“–”，而1︰640處變成“++++”，然后再進(jìn)行計(jì)算。X=Y+Y/4·ZX為需求的血清效價(jià)，Y為能引起血凝全部抑制最高血清稀釋度的倒數(shù)，Z為4減掉不能被抑制數(shù)（指全抑制高一個(gè)稀釋度處）。鑒定結(jié)果判斷：（1）標(biāo)準(zhǔn)參

7、照血清對分離的抑制效價(jià)達(dá)≥20才可算為陽性。（2）一個(gè)分離物不能被兩種或以上標(biāo)準(zhǔn)參照血清同時(shí)有≥20的抑制。（3）一個(gè)分離物被H3N2免疫血清有≥20抑制，而H1N1和乙型免疫血清抑制效價(jià)均<20?？烧J(rèn)為分離物H3亞型病毒，同理僅被H1N1免疫血清有≥20或僅被乙型免疫血清有≥20抑制，可認(rèn)為分離物為H1亞型病毒或乙型病毒。（4）三種標(biāo)準(zhǔn)參照血清對分離的抑制物效價(jià)均<20，速將分離物送國家流感中心進(jìn)一步鑒定。交叉血凝抑制測定和抗原比計(jì)算由于流感病毒的抗原性能經(jīng)常不斷地發(fā)生變異，變異程度與疾病發(fā)生與流行強(qiáng)度常成正相關(guān)。交

8、叉血凝抑制測定和抗原比計(jì)算仍為最簡便、可靠和敏捷地了解流感病毒抗原性是否已發(fā)生變異，其變異幅度有多大的一種手段。三、流感實(shí)驗(yàn)室檢測中應(yīng)注意的若干問題1.禁止在同一實(shí)驗(yàn)室和同一接種柜中，同時(shí)處理接種未知臨床標(biāo)本和已知陽性標(biāo)本。2.禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理接種采至不同動(dòng)物的標(biāo)本。動(dòng)物的標(biāo)本必須與人的標(biāo)本分別保存。3.接種后剩余原