T細(xì)胞表型及脾細(xì)胞分離ppt課件

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1、研究生實(shí)驗(yàn)一、T細(xì)胞表型測(cè)定（一）二、小鼠脾細(xì)胞分離技術(shù)實(shí)驗(yàn)一、T細(xì)胞表型測(cè)定（一）---免疫細(xì)胞的分離、細(xì)胞涂片、固定及保存原理：T細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的，不均一的整體，根據(jù)其發(fā)育的不同階段，表面標(biāo)記以及功能，可將其分為不同的亞群。T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且對(duì)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答起到輔助和調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞共有標(biāo)志：CD3+為總細(xì)胞T細(xì)胞特有標(biāo)志：CD4+細(xì)胞為輔助細(xì)胞，CD8+細(xì)胞為殺傷細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志正常值：正常人外周血中：CD3為60%～80%；CD4為35%～55%；CD8為20%～30%CD4/CD8的正常值約1.4～2.

2、0。CD4／CD8＜1.4：①免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5；②惡性腫瘤；③再生障礙性貧血；④某些病毒感染。CD4／CD8＞2.0：自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)，有助于了解機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，對(duì)免疫缺陷病、腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反應(yīng)等疾病的診斷、分型、預(yù)后和療效觀察有著重要的意義。SABC-AP法測(cè)定T細(xì)胞亞群SABC：為鏈酶親和素－生物素，AP為堿性磷酸酶。鏈酶親和素：是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子結(jié)合。親和素與生物

3、素一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定，形成一種類似晶格的復(fù)合體。Tcell待測(cè)T細(xì)胞CD分子（？？？）一抗二抗底物實(shí)驗(yàn)基本流程實(shí)驗(yàn)材料肝素、淋巴細(xì)胞分層液、Hank’s液、PBS等；一次性注射器、試管、滴管、離心機(jī)、微量移液器、玻片、顯微鏡，溫箱等。鼠抗人CD3、CD4、CD8單克隆抗體（1抗）；羊抗鼠IgG（生物素化2抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT磷酸甲苯胺藍(lán)鹽）等。實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)本的制備：淋巴細(xì)胞懸液的制備標(biāo)本的染色：結(jié)果的觀察：標(biāo)本制備：淋巴細(xì)胞懸液的制備（1）取肝素抗凝血5ml與5mlHank’s液稀釋混勻，每組取2ml，用滴管貼管壁輕輕

4、疊加于2ml分離液上，配平后1500rpm離心10mins。（2）洗滌細(xì)胞：用滴管仔細(xì)吸出位于血漿和分離液之間乳白色的淋巴細(xì)胞，放入盛有2mlHank’s液的試管，1500rpm離心10mins，棄上清，將沉淀的淋巴細(xì)胞輕彈混勻后加入Hank’s液重復(fù)洗滌一次，最后一次用PBS洗滌。（3）棄去上清，淋巴細(xì)胞沉淀用200μlPBS溶解，取20μl細(xì)胞涂片，下一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞亞群用。標(biāo)本染色細(xì)胞涂片用記號(hào)筆劃圈，滴固定液1滴，室溫固定2～3分鐘。滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗體15μL，輕輕搖晃，使單抗均勻鋪在細(xì)胞表面，37℃孵育2～3h

5、，PBS洗3次。滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠抗體15μL，37℃孵育30～45分鐘，PBS洗3次。滴加SABC15μL，37℃孵育30～45分鐘，PBS洗3次。滴加顯色劑30～50μL，室溫顯色20～40分鐘?？稍陲@微鏡下觀察，待細(xì)胞膜上出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時(shí)，用PBS淋洗。滴加細(xì)胞核復(fù)染液1滴，30秒后自來水淋洗。顯微鏡下觀察結(jié)果。注意事項(xiàng)：以上操作中，37℃孵育時(shí)應(yīng)將玻片置于濕盒中，切勿干片，特別是加底物后，干片將導(dǎo)致陰陽(yáng)性結(jié)果不能分辨。觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)使涂片保持濕潤(rùn)。觀察結(jié)果高倍鏡下計(jì)數(shù)100～200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。計(jì)算陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞表面呈紅

6、色。①標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性：細(xì)胞表面呈紅色，可見深藍(lán)色細(xì)胞核；②強(qiáng)陽(yáng)性：細(xì)胞周緣及中央均呈紅色，看不見細(xì)胞核；③弱陽(yáng)性：細(xì)胞表面呈淡紅色，可見淡蘭色細(xì)胞核；④陰性細(xì)胞：細(xì)胞表面無著色反應(yīng)，呈淡蘭色。注意事項(xiàng)：為防止試劑受到污染，加樣器吸頭最好為一次性使用。分離單個(gè)核細(xì)胞中，將稀釋血液加于分層液上時(shí)，務(wù)必要使之形成良好的界面，否則影響分離結(jié)果。孵育過程中，應(yīng)將涂片置于濕盒中，操作中始終要注意保持涂片的濕潤(rùn)，以確保得到完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。淋洗時(shí)不要直接對(duì)著細(xì)胞沖，避免細(xì)胞脫落。淋洗后，加試劑前須擦干細(xì)胞圈外水分，以免試劑流散。實(shí)驗(yàn)二小鼠脾細(xì)胞分離與制備技術(shù)分離

7、小鼠脾細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，胎盤藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠。細(xì)胞培養(yǎng)液。試管，滴管，離心機(jī)，培養(yǎng)皿，100目細(xì)胞篩等。選擇小鼠，拉脫頸椎處死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪開皮膚，打開腹腔。找到紅色的脾臟，用鑷子分離后摘除。將脾臟放入盛有5-10ml培養(yǎng)液的平皿中輕輕漂洗，并細(xì)心剝除脾臟周圍的結(jié)締組織。將脾臟移入另一個(gè)盛有5-10ml培養(yǎng)液的平皿中，輕輕漂洗后置于100目細(xì)胞篩中，輕輕擠壓使脾細(xì)胞通過篩孔進(jìn)入培養(yǎng)液中，反復(fù)沖洗，以取得脾細(xì)胞懸液。1、分離小鼠脾細(xì)胞收集分離出的脾細(xì)胞，置于10ml離心管內(nèi)加入培養(yǎng)液吹打

8、，取10μl細(xì)胞，與10μl胎盤藍(lán)染液混勻后染色并觀察細(xì)胞活力，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞活力觀察（臺(tái)盼藍(lán)染色）：細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，被染