高麗參水溶性多糖GPⅢ的分離純化及組成研究.doc

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1、高麗參水溶性多糖GPⅢ的分離純化及組成研究【摘要】目的：從高麗參中提取出水溶性粗多糖GP，經(jīng)分離純化，得到均一多糖GPⅢ，研究其組成等性質(zhì)。方法:粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白，DEAESepharoseCL6B柱層析分離純化得到GPⅢ，經(jīng)HPLC和醋酸纖維素薄膜電泳法檢驗(yàn)其均一性。結(jié)果：GPⅢ是均一組分多糖，GC分析它的單糖組成是葡萄糖。結(jié)論：GPⅢ是均一組分多糖，GC分析單糖組成是葡萄糖，方法準(zhǔn)確?！娟P(guān)鍵詞】高麗參分離純化組成　　高麗參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey的干燥根。主產(chǎn)于我國東北地區(qū),朝鮮和日本，俗稱別直參［1］。本文對(duì)高麗參粗多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)它的

2、組成成分等性質(zhì)進(jìn)行了研究?！　?材料、試劑與儀器　　1.1材料高麗參:購于遼寧丹東。　　1.2試劑與儀器單糖標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司試劑；DEAEsepharoseCL6B凝膠為Pharmacia公司產(chǎn)品；其他試劑均為上?；瘜W(xué)試劑有限公司分析純。MC992自動(dòng)核酸蛋白分離層析儀，上海滬西分析儀器廠；高效液相色譜，安捷倫HP1100；氣相色譜儀，安捷倫6890N。　　2實(shí)驗(yàn)方法　　2.1高麗參粗多糖的提取準(zhǔn)確稱取高麗參250g，加入一定體積80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6h，離心得提取液。殘?jiān)娓珊?，?0g加入3000mL的蒸餾水，在80℃恒溫水浴下提取2h，過濾，濾液在60℃下減壓

3、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，離心，上清液加入4倍體積無水乙醇進(jìn)行醇沉，放置4℃冰箱中過夜。次日離心10min(3000r/min)，取沉淀，常規(guī)干燥得粗多糖GP?！　?.2粗多糖的分離與純化［23］　　2.2.1脫蛋白3%糖溶液，按木瓜蛋白酶：蛋白質(zhì)1：50取蛋白酶，加入糖溶液中，將糖液裝入透析袋，37℃，保溫24h，加少量二甲苯防腐。按糖液總體積1/4加入Sevage試劑(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分振蕩2～3h，靜止，離心，取上清重復(fù)，至無游離蛋白為止?！　?.2.2粗多糖的DEAESepharoseCL6B柱層析制備500mg經(jīng)脫蛋白后得GP溶于10mL蒸餾水,先后用蒸餾水和01MNaCl

4、進(jìn)行洗脫，流速調(diào)為40mL/h，1管/12min，自動(dòng)部分收集器收集。用苯酚3硫酸法測(cè)定糖的分布情況，按各個(gè)波峰范圍部分收集洗脫液，由分離層析儀中的UV160A紫外光譜于280nm下同步檢測(cè)蛋白質(zhì)?！　?.3多糖樣品純度鑒定方法［4］多糖樣品的純度鑒定采用高效液相色譜法和醋酸纖維素薄膜電泳法。高效液相色譜柱為SUGARKS804，水作流動(dòng)相，流速1mL/min，柱溫50℃，示差檢測(cè)器檢測(cè)?！　?.4紅外光譜分析取2mg糖樣，KBr亞片，紅外光譜分析?！　?.5糖組成分析［46］10mg的糖樣溶于10mL2M三氟乙酸120℃水解6h，水解產(chǎn)物用無水乙醇蒸除三氟乙酸至中性，干燥產(chǎn)物進(jìn)行衍

5、生物的制備(硅烷化)。氣相色譜柱是HP5毛細(xì)管柱(30m×0.32mm,0.25μm)，柱溫采用程序升溫即160℃20℃/min180℃10℃/min220℃(2min)，檢測(cè)器和進(jìn)樣口溫度均是230℃?！　?.6分子量測(cè)定［4］取標(biāo)準(zhǔn)樣品(T10、T40、T70、T500、藍(lán)色葡聚糖、葡萄糖)及待測(cè)樣品溶于去離子水中，用0.4μ纖維素膜過濾，進(jìn)樣，測(cè)出各自的保留時(shí)間。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間,按公式Kav(VeVo)/(VtVo)求出對(duì)應(yīng)的Kav,以LogMw對(duì)Kav作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣測(cè)出樣品的保留時(shí)間,求出其Kav從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可求出其分子量?！　?結(jié)果與分析　　3.1粗

6、多糖的提取與分離純化高麗參經(jīng)水提取,粗多糖GP得率為28.05%。GP經(jīng)脫蛋白后，上DEAESepharoseCL6B柱層析制備，按01MNaCl制定洗脫曲線，GP的NaCl梯度洗脫液經(jīng)苯酚硫酸檢測(cè)只含有一個(gè)糖洗脫峰，紫外檢測(cè)儀在280nm下也檢測(cè)到1個(gè)蛋白質(zhì)洗脫峰，并且與糖洗脫曲線相吻合，推測(cè)此糖組分可能含有結(jié)合蛋白質(zhì)，收集42～60管洗脫液，透析，濃縮，醇沉，沉淀常規(guī)干燥命名為GPⅢ。　　3.2GPⅢ的純度鑒定配制0.1%的樣品液，0.4μ纖維素膜過濾，進(jìn)樣量20μL。GPⅢ的高效液相色譜結(jié)果檢測(cè)出一條峰，證明GPⅢ是純度較好的樣品。GPⅢ在醋酸纖維素薄膜電泳上也跑出來一條區(qū)帶，

7、再次驗(yàn)證GPⅢ為成分單一的一種多糖。　　3.3GPⅢ的分子量鑒定GPⅢ的保留時(shí)間分別是6.085,查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得GPⅢ的分子量分別在40萬左右?！　?.4GPⅢ的性質(zhì)分析紅外光譜分析表明，GPⅢ在3600～3200cm有OH吸收峰,在2923cm左右有一強(qiáng)吸收峰,為CH、CH2共振吸收峰,在1635cm左右有多糖的水合振動(dòng)峰。GPⅢ經(jīng)酸水解，衍生化后的氣相色譜結(jié)果(圖略)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖，中間