水溶性水溶性海星皂苷的分離純化及其抗真菌活性研究

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1、水溶性海星皂苷的分離純化及其抗真菌活性研究何穎北京化工大學北方學院化藥1107摘要：為了分離純化出具有強抗真茵活性的水溶性海星皂苷，以羅氏海盤車(Aster／asroUeston／)腕為實驗材料，利用水抽提方法獲得水溶性海星皂苷粗品，依次利用大孔樹脂和硅膠柱層析對水溶性海星皂苷進行了純化，并對其抗真茵活性進行了測定。研究結果發(fā)現(xiàn)，在30％、50％、70％、80％、95％乙醇溶液的大孔樹脂柱層析洗脫組分中，70％乙醇溶液洗脫組分對白色念珠茵和裂殖酵母菌的抗真菌活性最強。70％乙醇溶液洗脫組分經(jīng)硅膠柱層析進一步純化后，得到了SF-1、SF-2、SF-3和SF-4四種純化樣品，其

2、中SF-I純化樣品沒有抗真菌活性，SF．2純化樣品具有極弱的抗真茵活性，SF-3和SF-4純化樣品均具有很強的抗真菌活性。SF-3純化樣品在高壓液相柱層析(HPLC)圖譜中僅顯示單一洗脫峰，表明其純度很高，可應用于高效抗真菌藥物的研制。研究結果為利用水溶性海星皂苷研制高效抗真菌藥物奠定了基礎。關鍵詞：海星；水溶性海星皂苷；抗真菌活性；大孔樹脂柱層析；硅膠柱薄層層析皂苷，又稱皂甙，是一種廣泛存在于植物以及海洋棘皮動物中的、具有多種藥理學活性的物質。海星皂苷是海星的次生代謝產(chǎn)物，對純的海星皂苷的大量試驗表明它們具有多種藥理活性：溶血活性、腫瘤細胞毒性、抗病毒作用、抗革蘭氏陽性菌

3、活性、阻斷哺乳動物神經(jīng)肌肉傳導作用、Na+／K+．ATP酶抑制作用、抗?jié)冏饔靡约翱寡住⒙樽砗徒笛獕夯钚缘取?。目前，對海星皂苷的制備多采用甲醇、乙醇等稀醇提取法協(xié)3J，這種工藝方法冗長復雜、萃取率低H】，存在著有機溶劑使用量大、成本高、容易對環(huán)境造成污染等一系列缺點∞1；同時提取的海星皂苷水溶性比較差，應用時常需用促溶劑如DMSO等對其進行溶解，這在一定程度上影響了其抗真菌活性，也限制了其在臨床醫(yī)學上的應用范圍。到目前為止，國內外尚未見到對水溶性海星皂苷的報道極少，更沒有利用水溶性海星皂苷進行抗真菌活性的研究報道。本文利用水抽提法、大孔樹脂柱層析和硅膠柱層析從羅氏海盤車(A

4、ster／asrollestoni)腕中分離并純化出水溶性海星皂苷，篩選出具有顯著抗真菌活性的水溶性海星皂苷單體，為利用水溶性海星皂苷開發(fā)研制高效抗真菌藥物奠定基礎。1材料與方法1．1材料羅氏海盤車(Asteriasrollestoni)采自青島膠州灣海域，裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)和白色念珠菌(Candidaalbicans)由中國海洋大學微生物工程實驗室友情惠贈，采用YPD培養(yǎng)基(酵母浸膏O．5％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，瓊脂2％)于28cc培養(yǎng)；旋轉蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠，冷凍干燥機購自美國西盟(SIM)公司，AB一8型大孔樹

5、脂購自天津南開化工廠，硅膠板及層析用硅膠(200～300目)購自青島海洋化工廠，Agilentl100型高壓液相柱層析(HPLC)儀、RID檢測器和AgilentZORBAXEclipseXI)B．C18型HPLC層析柱(4．6mmX150mm，0．5舯)為美國Agilent公司產(chǎn)品，HPLC層析柱洗脫流動相所用乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。1．2水溶性海星皂苷的分離提取取新鮮羅氏海盤車腕，用勻漿器打碎，60℃水浴2h，期間不斷攪拌，16層紗布過濾后收集海星水提液。將海星水提液pH調整為10，上樣于預處理的AB．8型大孔樹脂柱(30mm×300mm)，蒸餾水洗柱后分別用

6、30％、50％、70％、80％、95％的乙醇溶液各300mL進行洗脫，收集各種洗脫組分，石油醚脫脂后使用正丁醇進行萃取，經(jīng)旋轉蒸發(fā)和冷凍干燥后備用。1．3大孔樹脂各洗脫組分抗真菌活性測定參照2005中國藥典中的管碟法№3進行抑菌環(huán)直徑的測定。將不同水溶性海星皂苷洗脫組分的凍干品配制成質量濃度為0．5mg／mL的生理鹽水溶液，分別測定其對裂殖酵母和白色念珠菌的抑菌環(huán)大小，測量抑菌環(huán)直徑并拍照。1．4水溶性海星皂苷的硅膠柱層析將篩選出的具有高抗真菌活性的大孔樹脂柱洗脫組分上樣于硅膠常壓柱(15mmX200mm)，利用混合展層劑(‰丁醇：圪馥乙脂：‰=4：1：5)系統(tǒng)進行連續(xù)洗脫

7、，收集洗脫組分(每管5mL)。對各洗脫組分進行硅膠板薄層層析，合并遷移率相同的洗脫組分，經(jīng)旋轉蒸發(fā)和冷凍干燥后備用。1．5水溶性海星皂苷各純化組分的抗真菌活性測定水溶性海星皂苷純化組分抑菌環(huán)直徑的測定方法同1．3。硅膠柱純化樣品的最低抑菌濃度(MIC)的測定參照叢日山等(20cr7)瓊脂稀釋法[5]。1．6水溶性海星皂苷純化樣品的純度鑒定稱取水溶性海星皂苷純化樣品的凍干品0．4嗚，用去離子水配制成質量濃度為0．5ms／mE的水溶液，取20止溶液上樣于AgilentZORBAXEclipseXDB-C1B(4．6in