酪蛋白的提取

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1、一、實驗?zāi)康?、掌握一種提取蛋白的方法。　　2、掌握一種檢測牛乳質(zhì)量的方法。二、實驗原理酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，約占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)，可以檢測牛乳中是否摻假。酪蛋白在其等電點時由于靜電荷為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，經(jīng)牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個性

2、質(zhì)被利用來從酪蛋白粗制劑中將脂類雜質(zhì)除去。三、儀器和試劑儀器：溫度計、布氏漏斗、pH試紙、抽濾瓶、電爐、燒杯、量筒、表面皿、天平等。試劑：　　1.95%乙醇、乙醚　　2.pH4.6乙酸鈉緩沖液0.2mol/L　　3.乙醇、乙醚混合液：乙醇∶乙醚=1∶1（體積比）　　4.市售牛乳四、實驗步驟1.酪蛋白等電點沉淀　　將100ml牛乳放到500ml燒杯中，加熱至40℃左右的乙酸鈉緩沖液，直到pH達(dá)4.6左右，用pH試紙或酸度計調(diào)試。將上述懸浮液冷卻至室溫，然后放置5min，用細(xì)布過濾，收集沉淀。2.除脂類雜質(zhì)　　將上述沉淀用少量水洗數(shù)次，然后

3、懸浮于30ml95%的乙醇中。將此懸浮液傾于布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液洗滌沉淀兩次，最后再用一米洗滌沉淀兩次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準(zhǔn)確稱重后，計算出每100ml牛乳所制備出的酪蛋白數(shù)量（g%），并與理論產(chǎn)量（3.5g%）相比較，求出實際獲得百分率。一、實驗?zāi)康拿甘侵参矬w內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的生化反應(yīng)，一般都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒有酶的催化反應(yīng)，植物的生命也就停止了，因此對酶的研究是闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)中十分重要的部分。為要研究酶首先要將酶從

4、組織中提取出來，加以分離、純化，不同的研究目的對酶制劑的純度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制劑即可，而有些工作則要求較純的酶制劑，需根據(jù)不同情況區(qū)別對待。在酶的提取和純化過程中，自始至終都需要測定酶的活性，通過酶活性的測定以監(jiān)測酶的去向。二、實驗原理（一）酶的提取1.酶的存在位置??　　存在于動植物以及微生物的細(xì)胞的各個部位。2.如何將酶從細(xì)胞中分離?　　從高等植物中提取酶常遇到一些實際問題，首先是細(xì)胞中含有許多種酶，每種酶的濃度又很低，只占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的極小部分（葉中的雙磷酸核酮糖羧化酶除外），而許多植物組織中蛋白質(zhì)的含量又很低

5、。此外，各種酶的存在狀態(tài)不同，有在細(xì)胞外的外酶，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)酶，內(nèi)酶中又有與細(xì)胞器一定結(jié)構(gòu)相結(jié)合的結(jié)合酶，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中，提取時都應(yīng)區(qū)別對待，作不同處理。如果酶僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，只要將細(xì)胞破碎，酶就會轉(zhuǎn)移到提取液中；但如果是與細(xì)胞器（如細(xì)胞壁、細(xì)胞核、線粒體、原生質(zhì)膜、微粒體等）緊密結(jié)合的酶，這時如僅僅破碎細(xì)胞還不夠，還需要用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚笍倪@些結(jié)構(gòu)上溶解下來。其次，細(xì)胞中存在抑制物質(zhì)，如酚，酸，離子等，它們通常在液泡中，當(dāng)細(xì)胞破碎時，這些物質(zhì)象蛋白質(zhì)一樣從細(xì)胞中釋放出來，進(jìn)入提取液中，特別是酚類物質(zhì)，具有游離的酚羥基，能與蛋白質(zhì)

6、肽鍵的氧原子形成強的氫鍵，不能為一般的實驗方法，如透析和凝膠過濾所解離。酚易氧化產(chǎn)生醌，醌為一種強氧化劑，會使蛋白質(zhì)的功能團發(fā)生氧化或發(fā)生聚合，使蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基團，如-SH，-NH2，通過1，4-加成反應(yīng)而發(fā)生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物組織和提取液產(chǎn)生棕色，以致影響酶活性的測定。因此如果沒有特殊需要，一般常選用植物的非綠色部分或者黃化的幼苗，在這些組織中一般酚類化合物含量較低。在提取過程中為了盡量減少酚類的影響，一般提取液常選用高pH值的緩沖溶液，因為在高pH值時，酚類大部游離而不與蛋白質(zhì)形成強的氫鍵，但高pH值促進(jìn)酚類氧化

7、，同時降低酚類吸附劑（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已經(jīng)知道PVP能與游離酚羥基形成強的氫鍵復(fù)合物，是酚類化合物的有效結(jié)合劑。在提取線粒體時加入可溶性PVP，提取可溶性酶時加入不溶性交聯(lián)PVP（Polyvinylpolypyrrolidone，簡稱PVPP，或PolyclarAT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金屬元素及PVP單體，可加10%HCl煮沸10分鐘，用NaOH中和，再用水洗幾次，直至中性，純化后的PVPP不必干燥就可直接應(yīng)用。　　植物細(xì)胞有堅韌的細(xì)胞壁，需要強烈的方法去破碎，少量樣品可用研

8、缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發(fā)熱，所用器皿和溶液需要預(yù)冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘渣再