牛奶中酪蛋白的提取與分析

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1、實驗題目：牛奶中酪蛋白的提取與分析實驗材料：牛奶小組成員：實驗時間：一：實驗題目：牛奶中酪蛋白的提取與分析二：報告撰寫者三、小組成員實驗儀器溫度計、布氏漏斗（*）、pH試紙（*）、抽濾瓶（*）水浴鍋、燒杯、量筒、表面皿（*）、電子天平（*）、2個1000ml的容量瓶（*）、2張醋酸纖維薄膜（2cm×8cm厚度120nm）成品（*）、培養(yǎng)皿9—10cm（*）、毛細(xì)管（*）、尺子、鉛筆、單面刀片（*）、鑷子、普通濾紙（*）、電泳槽、玻璃板8cm×12cm（*）、752型分光光度計（*）、細(xì)布（*）0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml的移液管、試管、試管架、三、

2、實驗材料牛奶（蒙牛特侖蘇和伊利金典）四、實驗試劑特侖蘇400ml、金典200ml、1.66g巴比妥（*）、12.76g巴比妥鈉（*）、0.5g氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、0.2mol/L的乙酸100ml（*）、0.2mol/L的乙酸鈉100ml（*）、25g氫氧化鈉固體（*）標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白、15mg五水硫酸銅（*）、60mg酒石酸鉀鈉（*）所需試劑配制方法：乙醇乙醚混合液的配制：配制乙醇乙醚1:1的混合液10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚乙醇鈉緩沖液的配制：配制

3、pH4.6的乙酸鈉緩沖液（0.2mol/l）0.2mol/L的乙酸51ml0.2mol/L的乙酸鈉49ml巴比妥鈉緩沖液的配制：配制巴比妥鈉緩沖液（pH8.6,0.06mol./L）,將上述二者混合后定容于1000ml巴比妥1.66g巴比妥鈉12.76g染色液的配制：+40ml蒸餾水，混勻既得染色液0.5g氨基黑10B50ml甲醇AR10ml冰醋酸AR漂洗液的配制：45ml95%乙醇AR混勻得染色液5ml冰醋酸AR蒸餾水混勻得透明液透明液的配制：25ml的冰醋酸AR75ml的無水乙醇AR0.05mol/L氫氧化鈉溶液的配制：16g的氫氧化鈉固體定容至1000ml10

4、%氫氧化鈉溶液的配制：5g的氫氧化鈉固體定容至50ml溶于5ml蒸餾水，在攪拌情況下，加入10%氫氧化鈉溶液3ml，用蒸餾水稀釋到10ml，用棕色瓶避光保存雙縮脲試劑的配制：15mg五水硫酸銅60mg酒石酸鉀鈉標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）：用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制10ml從特侖蘇和金典中提取的酪蛋白樣品液1、2的配制（2-9mg/ml）：用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制10ml標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制從特侖蘇和金典中提取的酪蛋白樣品液3、4的配制（50-1500μg/ml）：用0.

5、05mol/L氫氧化鈉溶液配制七、實驗?zāi)康?.掌握從牛奶中提取酪蛋白的方法2.了解蛋白質(zhì)分離純化的基本辦法3.學(xué)習(xí)電泳的基本原理及掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離酪蛋白的具體操作4.掌握雙縮脲法和紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的原理及操作方法并比較兩種方法5.熟悉分光光度計的原理和操作6.比較特侖蘇與金典中的酪蛋白含量八、實驗原理酪蛋白在其等電點時靜電荷為零，同種電荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)節(jié)到PH4.6，酪蛋白就可以從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶解于乙醇，這個性質(zhì)被用來從酪蛋白中除去脂類雜質(zhì)。酪蛋白并不是單一的一種蛋白質(zhì)，而是多種性質(zhì)類似的蛋白質(zhì)的

6、統(tǒng)稱。其一般由αs—，β—，γ—，κ—4種類型組成。它們各自的等電點（pI）具有一定的差異，本實驗將酪蛋白溶液點樣于用pH8.6(高于酪蛋白各型等電點)緩沖液浸泡過的醋酸纖維膜上，并在該緩沖液體系中進(jìn)行電泳，使酪蛋白分子上帶上不同量的負(fù)電荷，在電泳過程中酪蛋白分子由負(fù)極向正極移動，同時酪蛋白各類型分子的相對分子量也不同，因此在電泳過程中其遷移率也不同，從而把酪蛋白的各種類型分離開來。酪蛋白各組分的含量、等電點及大小蛋白質(zhì)名稱含量（%）等電點相對分子質(zhì)量沉降系數(shù)αs—酪蛋白45~554.1230003.99β—酪蛋白25~354.5240001.57γ—酪蛋白8~15

7、4.1190001.4κ—酪蛋白3~75.8~6.0210001.55雙縮脲在堿性溶液中能與二價銅離子產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，該反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中因含有兩個以上的肽鍵，因此也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)在堿性溶液中與二價銅離子產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量稱正比，與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及相對分子質(zhì)量無關(guān)。故可用雙縮脲反應(yīng)來測定蛋白質(zhì)的含量，測定范圍為0.5-10mg/ml蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)分子中含有的酪氨酸、色氨酸等殘基中具有共軛雙鍵，使得蛋白質(zhì)在280nm處具有最大吸收值，且其光吸收值與濃度在一定范圍內(nèi)成正比，因此，該法可用作蛋白質(zhì)