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1、牛奶中酪蛋白的提取及含量測定一、實驗原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂類（4%）、蛋白質(zhì)（3.5%）、維生素、微量元素（Ca、P等礦物質(zhì)）、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一種二糖，它由D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵連接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，當(dāng)乙醇混入乳糖水溶液中時，乳糖會結(jié)晶出來，從而達(dá)到分離的目的。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和乳清蛋白兩種，其中酪蛋白占了牛乳蛋白質(zhì)的80%。酪蛋白是白色、無味的物質(zhì)，不溶于水、乙醇等有機(jī)溶劑，但溶于堿溶液。而乳清蛋白水合能力強(qiáng)，分散性強(qiáng)，在牛乳中呈高分子狀態(tài)。2、等電點沉淀法：在等電點時，蛋白質(zhì)分
2、子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等電點為4.7左右（不同結(jié)構(gòu)的酪蛋白等電點有所不同），本實驗中將牛乳的pH調(diào)值4.7時，酪蛋白就沉淀出來。市售牛奶通常會添加耐酸堿穩(wěn)定劑來增加粘稠度，以致即使pH調(diào)至等電點酪蛋白也沉淀的很少，故實驗時可將pH稍微調(diào)過多一點再調(diào)回等電點。同時，市售牛奶由于生產(chǎn)過程通常導(dǎo)致酪蛋白組分發(fā)生變化，因而使pI偏離了4.7，通常偏酸。3、酪蛋白的提純根據(jù)乳糖、乳清蛋白等
3、和酪蛋白的溶解性質(zhì)差異，可以用純水洗滌來除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的雜質(zhì)，再用乙醇除去脂類，然后過渡到用乙醚洗滌，由于乙醚很快揮發(fā)，最終得到純粹的酪蛋白結(jié)晶。4、蛋白質(zhì)含量的測定（考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法）考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G520的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍(lán)色，其最大吸收峰變?yōu)?95nm。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G520-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以測定蛋白質(zhì)濃度。二、實驗器材與試劑1、器材：恒溫水浴鍋、離心機(jī)、抽濾裝置、蒸發(fā)皿、精密pH試紙、旋渦
4、混合器、紫外分光光度計、試管*9、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL量筒、電子分析天平2、試劑：鮮牛奶、pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、乙醇-乙醚混合液（95%乙醇、無水乙醚體積比1：1）、0.9%NaCl溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考馬斯亮藍(lán)G520染液三、實驗操作記錄1、酪蛋白的制備將20mL牛奶盛于100mL的燒杯中加熱到40℃，在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖溶液20mL。用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.7，此時即有大量的酪蛋白沉淀析出。將上述懸浮液冷卻至室溫，離心5min（4000r/min），棄去上清液，沉淀即為酪蛋白粗品。用蒸餾水洗
5、滌沉淀3次（每次約20mL），離心5min（3000r/min），棄去上清液。在沉淀中加入約20mL95%乙醇，攪拌片刻，將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移到布氏漏斗中抽濾，用乙醇-乙醚混合溶液洗滌沉淀2次，最后用乙醚洗滌沉淀2次，抽干。將沉淀攤開在培養(yǎng)皿中，風(fēng)干，保存至下周。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支干凈干燥試管，按下表進(jìn)行編號并加入試劑?；靹?，室溫靜置3min，以第一管為空白，于波長595nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑編號1（空白）234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/mL——0.10.20.30.40.60.80.9%NaCl/mL1.00
6、.90.80.70.60.40.2考馬斯亮藍(lán)染液/mL4.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)濃度/(μg/mL)0102030406080A595nm0.0000.1510.2600.3260.4400.5350.6363、樣液的測定準(zhǔn)確稱取25mg自制酪蛋白，置于50mL燒杯中，加入約20mL0.9%NaCl，再準(zhǔn)確加入1mol/LNaOH5mL，當(dāng)酪蛋白溶解后，準(zhǔn)確加入1mol/L乙酸5mL，充分振搖直至酪蛋白完全溶解為止（不溶可在50℃水浴加熱至溶），全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加0.9%NaCl稀釋定容至50mL，充分搖勻。取5mL上述蛋白液，轉(zhuǎn)移至另一個50mL
7、容量瓶中，用0.9%NaCl稀釋定容至50mL。另取一支干凈試管，加入樣品液1.0mL及考馬斯亮藍(lán)染液4.0mL，混勻，室溫靜置3min，于波長595nm處比色，讀取吸光度，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。四、實驗結(jié)果1、酪蛋白產(chǎn)量及產(chǎn)率計算表2酪蛋白產(chǎn)量及產(chǎn)率計算酪蛋白質(zhì)量/g牛奶樣品質(zhì)量/g產(chǎn)率/g0.7820.033.89%2、標(biāo)準(zhǔn)曲線由散點圖可以看出，后兩個點與前面幾個點的線性關(guān)系并不好，出現(xiàn)了明顯的負(fù)偏差。故在線性擬合時舍去后兩個點，取前5個點進(jìn)行擬
