牦牛中性粒細(xì)胞防御素的分離純化及抗菌活性

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1、牦牛中性粒細(xì)胞防御素的分離純化及抗菌活性董開忠,余四九,楊具田,王冬梅,蔡勇,雒曉芳【摘要】　　目的:分離牦牛中性粒細(xì)胞(PMN)防御素并檢測(cè)其抗菌活性。方法:運(yùn)用Percoll密度梯度離心法,從新鮮牦牛全血中分離純化牦牛中性粒細(xì)胞,用50mL/L冰乙酸抽提,提取液經(jīng)BioGelP10聚丙烯酰胺凝膠過濾和反相高效液相色譜（RPHPLC）分離純化,對(duì)活性多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析,并對(duì)其中3個(gè)肽進(jìn)行氨基酸組成分析,用瓊脂彌散法檢測(cè)三種多肽的抗菌活性。結(jié)果:獲得13種活性多肽,其中三個(gè)肽為牦牛中性粒細(xì)胞防御素1～3,并具有很強(qiáng)的抗菌活性。結(jié)論:PMN存在防御素并具有廣譜抗菌活性,在天然免疫中發(fā)揮

2、著重要作用?！娟P(guān)鍵詞】牦牛;分離純化;中性粒細(xì)胞;防御素　　〔Abstract〕AIM:ToisolateandpurifyβdefensinfromtheneutrophilsofYak.METHODS:ThemethodofpercollgradientcentrifugationployedtopurifyneutrophilsfromYakperipheralblood.ThecrudeextractionfromYakneutrophilsL/Laceticacid,acidsolubleextractofYakneutrophilsidegelfiltrationandRP

3、HPLC,and9outof22apicesshoassspectrograph.Theantibacterialactivitiesoftheextractsfromeverystepolecularinedtobe4.2,4.6and4.8kDabymassspectrograph.BNBD13fromYakneutrophilsantimicrobialactivity,Yakdefensinhasanimportantpartininnateimmunit.　　〔Keyond等〔5〕于1991年首次在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),在哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)。

4、成熟的β防御素由38～42個(gè)氨基酸殘基組成,分子內(nèi)含有6個(gè)保守的半胱氨酸,序列中部有一個(gè)保守的脯氨酸和一個(gè)甘氨酸,6個(gè)半胱氨酸形成三對(duì)由Cys1Cys5、Cys2Cys4、Cys3Cys6方式連接的二硫鍵〔6〕。研究表明防御素在體外對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌〔7〕、真菌〔8〕、部分被膜病毒〔9〕和腫瘤細(xì)胞等均具有很強(qiáng)的殺傷活性,同時(shí)具有免疫激活、連接先天性免疫與獲得性免疫〔10〕,以及對(duì)炎癥、創(chuàng)傷及神經(jīng)損傷的修復(fù)等作用〔11〕。其作用研究已引起科研工作者的廣泛關(guān)注。牦牛是我國(guó)高原地區(qū)的特有動(dòng)物資源品種之一,具有耐氧、御寒、強(qiáng)抗病的生理特性。目前有關(guān)家畜、豚鼠、家兔和人的中性

5、粒細(xì)胞防御素在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道,而對(duì)牦牛中性粒細(xì)胞（Polymorphonuclear,PMN）防御素的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在從PMN分離出具有抗菌活性的小分子多肽,并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究,以便對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行更深入的研究?！　?材料和方法　　1.1材料　　成年雄性牦牛由天祝藏族自治縣回民屠宰場(chǎng)提供,金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922）、枯草芽孢桿菌(ADB403)均由本中心保存;Percoll分離液、三氟乙酸為Sigma產(chǎn)品,BioGelP10為BioRadLaboratories產(chǎn)品,乙腈(Merck公司),抗菌肽indolicidin(牛)購(gòu)自美

6、國(guó)肽公司,冰醋酸(分析純)為南京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1PMN的獲取　　用無菌方法采集牦牛新鮮血液(EDTA抗凝)800mL,用比重1.086～1.115的Percoll密度梯度離心液分離全血中的中性粒細(xì)胞,獲取的多形核細(xì)胞層用等滲鹽水洗滌3次后,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算活細(xì)胞率?！　?.2.2牦牛中性粒細(xì)胞酸提取物的制備　　將純化的中性粒細(xì)胞在0.34mol/L冷蔗糖溶液中勻漿,然后將細(xì)胞勻漿液離心,1500r/min離心10min,沉淀物用上述蔗糖液洗滌并再次離心1～3次,收集上清液。上清液經(jīng)17000r/min,4℃離心30min,淡黃色沉淀物即為中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的顆

7、粒組分。然后將中性粒細(xì)胞顆粒組分加入50mL/L冰醋酸,在2～4℃環(huán)境中攪拌過夜（18～24h）,之后經(jīng)17000r/min,4℃離心30min,收集上清液濃縮至相當(dāng)于2.0×1012/L備用,蛋白濃度約為30g/L。凍干備用。　　1.2.3BioGel聚丙烯酰胺凝膠過濾純化　　將冷凍干燥的PMN提取物溶解于5mL去離子水中,根據(jù)A值調(diào)整稀釋度,使A為200,上樣于柱體積為2.6cm×100cmBioGelP10的層析柱,用5