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《泥鰍抗菌蛋白MAAP的分離、純化、表征及生物活性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、華中科技大學博士學位論文泥鰍抗菌蛋白MAAP的分離、純化、表征及生物活性研究姓名：董先智申請學位級別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導教師：徐輝碧;黃開勛2002.12.26華中科技大學博士學位論文滲}塒。o攜摘要．泥鰍(Loach．MisgurnusanguillicaudatusCantor)系鰍科動物，肉或全體入藥，收載于《中藥大辭典》等典籍中。其主要功效為補脾益氣、清熱解毒、消痞散結(jié)、祛濕邪，治消渴、水腫黃疸、痢疾、陽痿等癥。民間常用其粘液治療癰腫、中耳炎；用活泥鰍搗碎外敷治療乳癌、骨髓炎等，療效顯著。從這些療法
2、的特征來看，有可能是通過泥鰍體內(nèi)的某種生物活性分子而起作用，但目前關(guān)于泥鰍活體中這些活性物質(zhì)的報道較少。本文報道了從泥鰍活體內(nèi)分離、純化出的一種新的具有抗菌活性的蛋白質(zhì)分子MAAP(Misgurnusanguillicaudatusantimicrobialprotein)，同時對其理化特征及生物活性進行了研究。先成的工作主要包括以下幾個方面：從泥鰍活體內(nèi)純化出泥鰍抗菌螢白MAAP。使用粗分離、SephadexG一50凝膠過濾層析、DE．52Cellulose陰離子交換層析等方法將泥鰍抗菌蛋白逐步純化，最終用非變性
3、PAGE電泳得到具有較高純度的MAAP樣品，其產(chǎn)率為O．028％。用SDS．PAGE、尿素．SDS．PAGE監(jiān)測蛋白質(zhì)的純化進程，發(fā)現(xiàn)粗分離、SephadexG一50；疑膠過濾層析、DE．52Cellulose陰離子交換層析等一系列步驟均不足以得到均一的蛋白樣品；ND—PAGE是最終分離MAAP的關(guān)鍵步驟。用HPLC、IEF、TLC等多種方法對MAAP進行了一系列的純度鑒定，其結(jié)果均指示MAAP為一個純凈的蛋白質(zhì)。用多種方法對MAAP分子的理化特性進行了表征。用MALDI-TOF-MS法測定MAAP的分子量為11,
4、536Dalton；用IEF測得MAAP的等電點為4．78：氨基酸組成分析結(jié)果表明MAA約含111個氨基酸，主要由lO種氨基酸組成，其中半胱氨酸是含量最高的氨基酸，每個MAAP分子中約含有22個Cys：紫外光譜測定表明MAAP在192nnl處有多肽的特征吸收峰，在該波長處的消光系數(shù)為1．03×106Lmol-IClll～；MAAP經(jīng)TPCK．胰蛋白酶降解后進行MALDI．TOF-MS分析，得到16／卜肽碎片峰；N端序列分析表明MAAP的前5個氨基酸的排列順序為cyS．Phe．Gly．Trp．Asn。一系列鑒定實驗的
5、結(jié)果提示MAAP不含有亞基、糖配基、脂配基和金屬絡(luò)合離子，是一個單鏈的簡單蛋白質(zhì)。對MAAP進行了相似性檢索，經(jīng)權(quán)成檢索工具在世晃范圍內(nèi)檢索，均未找到與MAAP匹配的蛋白質(zhì)，提示MAAPI華中科技大學博士學位論文是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。用聚．L。賴氨酸構(gòu)象模型法、Raman二階導數(shù)譜法、FT-IR去卷積擬合法和概率模型法研究了MAAP的二級結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明：MAAP中a螺旋含量約為25％：p折疊約49％，p轉(zhuǎn)角約16％；無序結(jié)構(gòu)含量在10％左右。研究結(jié)果提示MAAP內(nèi)部存在一個主要由a螺旋和D折疊形成的高度有序的疏
6、水核心，疏水核內(nèi)的肽鏈通過Cys形成的二硫鍵相互交聯(lián)從而形成了穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。采用比濁法和平板抑菌實驗研究了MAAP的抗菌活性，實驗結(jié)果表明MAAP對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用且量效關(guān)系明顯：采用連苯三酚自氧化體系研究了MAAP的抗氧化活性，結(jié)果表明MAAP能有效清除連苯三酚自氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子。這些結(jié)果表明MAAP是抗菌藥物開發(fā)中一個有潛力的先導化合物分子。y＼／關(guān)鍵詞：泥鰍蛋白質(zhì)純化表征生物活性抗菌肽、／、／，。一，。、。＼一，7II華中科技夫?qū)W博士學位論文===≮=≈=；#==
7、=；##；=；㈣#；=∞％_=；《∞#=自∞㈣AbstractLoachisakindoffishthatbelongstOthefamilyofMisgurnusanguitlicaudatusCantor．Itisrecordedin‘‘ADictionaryOfChineseTraditionalMedicine’’thatitsmeatorwholebodycallbeusedasChinesetraditionalmedicine．Themainpharmaceuticalfunctionsofloach
8、seeninfolkrecipesaretonourishspleenandenrichvitalenergy,torelieveinternalheatanddetoxi魏toeliminatecarbunclesandloosenscabs，toprotectliverandbringdownjaundice．Chinesepeoplehavebeenu
