實驗九 細(xì)菌生化鑒定

《實驗九 細(xì)菌生化鑒定》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、實驗九細(xì)菌的生化鑒定一、實驗?zāi)康?、了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)的測定方法；2、掌握糖發(fā)酵試驗、淀粉實驗、吲哚實驗、M.R.及V.P的原理、方法及相應(yīng)培養(yǎng)基的制備方法。3、了解細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義；4、掌握以上實驗的用途。二、實驗原理各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。由于細(xì)菌特有的單細(xì)胞原核生物特性，這種差異就表現(xiàn)得更加明顯。不同細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，故不同細(xì)菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，它們對物質(zhì)的代謝譜和分解產(chǎn)物也就不同，細(xì)菌的這種代謝特點(diǎn)可供鑒別細(xì)菌之用。用生理生化試驗的

2、方法檢測細(xì)菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生理生化反應(yīng)，其在菌株的分類鑒定中具有主要意義。1、糖發(fā)酵實驗不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相同。其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同，如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判定。在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溟甲酚紫［PHS.2（黃色）一6.8（紫色）]，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明。發(fā)酵后產(chǎn)生的有機(jī)酸：乳酸、醋酸、丙酸等（溴甲酚紫變色范圍pH5.2~6.8,pH<5.2黃色，pH>6.8紫色）；

3、發(fā)酵后產(chǎn)生的氣體：甲烷、氫、二氧化碳等（杜氏小管內(nèi)有氣泡，產(chǎn)氣漂?。?、M.R.及V.P實驗很多細(xì)菌，如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下，這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4（紅色）-pH6.2（黃色）。若某些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但很快將丙酮酸脫梭，轉(zhuǎn)化成醇等物，則培養(yǎng)基的pH仍在6.2以上，故此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基的甲基紅指

4、示劑由橘黃色變?yōu)榧t色。VP試驗是用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧后生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物。3、吲哚實驗吲哚試驗是用來檢測吲哚的產(chǎn)生。有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。4、淀粉水解實驗微生物對大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通過加水裂解大分子物質(zhì)為較

5、小的化合物，使其能被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。這些過程可以通過觀察細(xì)菌菌落周圍物質(zhì)的變化來證實。如可以用滴加碘液到菌落周圍看是否變藍(lán)色來檢查是否產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸會使培養(yǎng)基pH下降，可以在培養(yǎng)基中事先加入中性紅試劑，培養(yǎng)基會從淡紅色變?yōu)樯罴t色。5、觸酶實驗觸酶又稱過氧化氫酶，具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故常用此試驗來鑒定。6、三糖鐵實驗（硫化氫產(chǎn)生實驗）某些

6、細(xì)菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)，形成黑色的硫化鐵沉淀，為硫化氫試驗陽性。細(xì)菌能發(fā)酵乳糖和蔗糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）。三、實驗儀器、材料和用具1、實驗儀器：37℃恒溫培養(yǎng)箱。2、微生物材料：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌種平板各1個。3、試劑：40％NaOH溶液、乙醚、甲基紅試劑、50g/Lα－萘酚(95％乙醇溶液)、30%雙氧水和1%溴麝香草酚藍(lán)酒精液。4、用具：接種環(huán)、酒精燈、鑷子、試管和杜氏小套管5、培養(yǎng)基及其配方：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖和山梨醇）和三糖鐵培養(yǎng)基。（1）淀粉

7、培養(yǎng)基100ml（分裝于四個三角瓶，包扎，121~126℃滅菌20min）：蛋白胨，2g；可溶性淀粉，0.4g；氯化鈉，1g；瓊脂，3~4g；酵母提取物，1g；加單蒸水定容至100ml，調(diào)整pH為7.2。（2）糖發(fā)酵培養(yǎng)基：100ml（分裝于試管，包扎，105℃滅菌20min）：蛋白胨2g;氯化鈉，1g；葡萄糖，1g；加單蒸水定容100ml；pH調(diào)整為為7.4。溴甲酚紫溶液（1.6%水溶液）1ml（3）M.R.及V.P實驗培養(yǎng)基（葡萄糖胰蛋白胨水培養(yǎng)基）：100ml（分裝于試管，包扎，105℃滅菌20min）：蛋白胨0.5g;K2HPO4，0.5g；葡萄糖，0.5

8、g；加單蒸