fasl基因rna干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

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1、FasL基因RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定龔青1,2徐進(jìn)文3（通訊作者）徐祖敏2高國全2（1廣州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生化教研室510180）（2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生化教研室510080）（3廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院生理教研室510080）【摘要】目的構(gòu)建細(xì)胞凋亡受體通路相關(guān)蛋白FasL表達(dá)的RNA干擾（RNAi）質(zhì)粒，為研究FasL參與的細(xì)胞信號通路提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA干擾質(zhì)粒。方法選取FasL基因的19nt特異性序列，設(shè)計針對FasL的shRNA序列，應(yīng)用基因重組技術(shù)克隆到pSilencer1.0-U6表達(dá)載體中,EcoRI和ApaI進(jìn)行雙酶切和DN

2、A測序鑒定重組克隆，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下含F(xiàn)asL基因RNAi的重組載體轉(zhuǎn)染臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)炎48h后，收集細(xì)胞裂解液，Westernblotting分析對照組與轉(zhuǎn)染組FasL蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果雙酶切證實shRNA正確插入pSilencer1.0-U6質(zhì)粒,DNA測序證實插入的序列正確；FasL基因RNAi的載體轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞成功;Westernblotting結(jié)果顯示與空質(zhì)粒對照組比轉(zhuǎn)炎組細(xì)胞FasL表達(dá)下調(diào)。結(jié)論成功構(gòu)建人FasL基因RNA質(zhì)粒，為研究FasL參與的細(xì)胞信號通路提供了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞載體?！娟P(guān)鍵詞】載體FasLRNAi胞

3、外的死亡信號可通過死亡受體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)。死亡通路在免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能中起重要作用，F(xiàn)asL參與許多細(xì)胞因子和藥物對細(xì)胞的調(diào)控作用，是許多抗腫瘤藥物的作用機(jī)制。RNA干擾（RNAi）是雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，是目前研究基因功能強(qiáng)有力的工具之一［1］。木研究以siRNA介導(dǎo)FasL表達(dá)沉默，采用脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染試劑，觀察siRNA導(dǎo)入后對人內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC內(nèi)的FasL表達(dá)的抑制作用,為研究FasL參與的細(xì)胞信號通路提供了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾質(zhì)粒。1材料和方法1.1材料：載體質(zhì)粒為pSilencer1.0-U6;大腸桿菌DH25α

4、為木實驗室保存；限制性內(nèi)切酶EcoRI和Apal,T4DNA連接酶購自美國Invitrogen公司;DNA膠回收試劑盒購自美國Qiagen公司；lKbLadder購自廣州東盛生物科技有限公司;1640、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、Gibco胎牛血清購自Invitrogen公司;質(zhì)粒抽提試劑盒為NucleoBondXtraMiDiEF（美國）。1.2方法1載體的構(gòu)建和鑒定：pSilencer1.0-U6Vector為RNA干擾專用載體。按照siRNA靶序列設(shè)計原則，選取基因mRNA序列特異的19個寡核苷酸作為siRNA干擾區(qū)域,自行

5、設(shè)il?一對針對FasL的shRNA互補(bǔ)序列，插入pSilencer1.0-U6。本研宄構(gòu)建了FasL干擾序列如下：1.Fas-L–BS/U6-Al：5'-CGGAAGACACCTATGGAATTTTCAAGAGAAATTCCATAGGTGTCTTCCTTTTTTG-3'2.Fas-L–BS/U6-A2:5'AATTCAAAAAAGGAAGACACCTATGGAATTTCTCTTGAAAATTCCATAGGTGTCTTCCGGGCC-3'3.Fas-L–BS/U6-Bl：5'-CGCAGAACTCCGAGAG

6、TCTATTCAAGAGATAGACTCTCGGAGTTCTGCTTTTnG-3'4.Fas-L–BS/U6-B2：5'-AATTCAAAAAAGCAGAACTCCGAGAGTCTATCTCTTGAATAGACTCTCGGAGTTCTGCGGGCC-3'RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及提取利用分子克隆的方法將S的序列退火連接入載體，獲得siRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞獲得重組菌，挑選陽性克隆，培養(yǎng)并制備質(zhì)粒，用EcoRI和Apal雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆送公司測序證實。2重組菌大規(guī)模擴(kuò)增后用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA制備試劑盒(Nucleo

7、BondXtraMiDiEF)按說明書步驟提取質(zhì)粒,-80°C保存。3HUVEC的原代選擇性培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)：按文獻(xiàn)報道方法獲取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［2】，在鋪了2%的明膠的塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入含冇15%血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液，置于37°C,5%C02靜止培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)液，除去未貼壁的細(xì)胞。每隔2d換液1次，以維持細(xì)胞的營養(yǎng)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。4RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染(參考invitrogen的說明書)，質(zhì)粒DNA(μg)與脂質(zhì)體Lipofe

8、ctamine2000(μl)的比例為1:2.5。轉(zhuǎn)染細(xì)胞6h后，吸出無血清培養(yǎng)液，換成含10%FBS的培養(yǎng)液過夜，在特定的吋間點進(jìn)行相應(yīng)檢測。