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1、一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。既可以定性，又可以半
2、定量的Western是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。western顯色的方法主要有以下幾種：i.放射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECLiii.底物熒光ECFiv.底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。westernblotting實(shí)驗(yàn)試劑1.30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亞甲丙烯酰胺將
3、30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未聚合材料。2.4×Tris·Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91gTris堿（1.5mol/L），用1mol/L調(diào)節(jié)pH至8.8，補(bǔ)加H2O至
4、體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2gSDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。3.4×Tris·Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05gTris堿(0.5mol/L），用1mol/L調(diào)節(jié)pH至6.8，補(bǔ)加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4gSDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。4.4×SDS電泳緩沖液Trisbase24.2gGlycerin115.3g20%SDS20ml加水至總體積1000ml.應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液（Tris0.05
5、M,Glycerin0.38M,SDS0.1%）5.TEMED(N,N,N’，N’-四甲基乙二胺)TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合)6.10%過硫酸銨過硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基?？捎萌ルx子水配制小量10%(w/v）的貯存液并保存于4℃。由于過硫酸銨會(huì)緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制.二、操作步驟：(一)配膠1、注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲(chǔ)存
6、液避光存放于4℃，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。2、封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時(shí)用水飽和的異丁醇或
7、異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。3、灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)?/p>
8、肉眼觀的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。(10%的AP最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好棄掉.)(二)樣品處理1．培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）：⑴去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可
