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《121140041 錢昆 植物內(nèi)生菌分離》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、....植物內(nèi)生菌的分離錢昆121140041一、實驗目的1、掌握對植物內(nèi)生菌的分離處理方法。2、熟練掌握對細菌、真菌的染色觀察技術。3、了解微生物分子實驗的基本操作流程。二、實驗原理在植物的生態(tài)環(huán)境中，存在著各種各樣的微生物,它們有的附著于植物的表面，有的則生活于植物體內(nèi)。對于附著于植物表面和根際的微生物已有很多研究，而對于植物體內(nèi)微生物的研究卻剛剛起步。但有資料顯示,一些植物內(nèi)生微生物與宿主發(fā)生關系時，可明顯增強宿主的抗病性，提高植物的生產(chǎn)力。因此，合理利用植物的內(nèi)生微生物具有重要的理論意義和實用價值。植物內(nèi)生菌
2、作為微生物研究領域之一，近年來一直備受關注。內(nèi)生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的組織或器官內(nèi)部的微生物（主要為真菌和細菌）。其后的很長時間內(nèi)，內(nèi)生菌研究進展緩慢。直到1993年，美國蒙大拿州立大學Strobel等從短葉紅豆杉的韌皮部位分離到一株產(chǎn)新型抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌，從而啟發(fā)人們可從植物內(nèi)生菌尋找與植物產(chǎn)生的相同或相似的化合物，由此促進了植物內(nèi)生菌的研究。植物內(nèi)生菌為植物組織內(nèi)的正常菌群，包括植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌，廣泛分布于各種陸生及水
3、生的低等植物和高等植物中。內(nèi)生真菌是在宿主植物的莖和葉內(nèi)生存并完成生活周期的真菌。這類真菌中，有許多種類很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易識別。真菌感染植物組織，菌絲存在于細胞內(nèi)和細胞間。與病原菌不同，這些真菌對宿主植物幾乎沒有害處，它們和植物之間或者是相互依存的共生關系，或者是不太密切的共生關系。對于現(xiàn)已分離得到的植物內(nèi)生細菌，一般可分為專性內(nèi)生細菌與兼性內(nèi)生細菌，前者指至今只能在植物體內(nèi)分離得到的細菌；后者指能在植物根際與土壤中分離得到，也能在植物體內(nèi)分離得到的細菌，而且種類居多。根據(jù)內(nèi)
4、生細菌對宿主植物生長發(fā)育的影響可以將其分成三類：第一類對植物的作用是中性的，即尚未發(fā)現(xiàn)它們的內(nèi)生定殖對宿主植物生長與繁殖有影響；第二類對植物生長發(fā)育有促進作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通過固氮與分泌激素促進植物生長發(fā)育等；第三類對植物生長具有負面影響，在特別條件下接種到原宿主植物或另外的宿主植物會誘發(fā)植物病害。但需要注意的是，同種細菌定殖于不同宿主植物可能對宿主植物產(chǎn)生不同的影響。除根瘤菌外，還有放線菌侵入多種被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮體系。早在十九世紀后期，人們就發(fā)現(xiàn)了這類非豆科的根瘤，并發(fā)現(xiàn)根瘤
5、內(nèi)有生微生物，1881年布隆科斯特將它稱為Frankia，但當時并不知道它是什么微生物。確定內(nèi)........生菌是放線菌，將它分離出來，在人工培養(yǎng)上獲得純培養(yǎng)，并回接成功，則是1978年卡拉漢姆在楊梅科香蕨木上首次證實的。內(nèi)生菌在植物體中的生物量是很微少的，但植物內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分，可以通過自身的代謝產(chǎn)物或借助信號傳導作用對宿主產(chǎn)生影響?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對宿主植物至少有以下幾個方面的有益作用：固氮作用、促進宿主植物生長、抗逆境、抗病原真菌和細菌以及他感作用等。三、實驗器材實驗器材：植物葉片（如冬
6、青葉等）、燒杯（6個）、鑷子、剪刀、接種環(huán)、酒精燈、滅菌鍋、光學顯微鏡、載玻片、培養(yǎng)皿、錐形瓶、PCR擴增儀、電泳槽、凝膠槽、梳子、移液槍、微離心管等；實驗試劑：75%酒精、1%次氯酸鈉溶液、無菌水、結(jié)晶紫染液、蕃紅染液、碘液、95%酒精、緩沖液、瓊脂糖等。四、方法與步驟1、培養(yǎng)基的配置需要準備3種培養(yǎng)基即牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細菌、PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌、高氏培養(yǎng)基用于培養(yǎng)放線菌，每種培養(yǎng)基設置2次重復，即共配置6個培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方及簡單的操作流程：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：配方：牛肉膏0.6g、蛋白胨2g、Na
7、Cl1g、瓊脂4g、水200ml、pH7.4-7.6操作流程：依次稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中，熱水溶解→加入瓊脂，熱水融化，融化后加水至所需體積→調(diào)pHPDA培養(yǎng)基：配方：馬鈴薯40g、蔗糖3g、瓊脂4g、水200ml（自然pH）操作流程：加入馬鈴薯粉末，溶解→加入瓊脂，熱水融化→加入葡萄糖，攪拌均勻→稍冷卻后，加水至所需體積高氏培養(yǎng)基：配方：可溶性淀粉4g、NaCl0.1g、KNO30.2g、K2HPO40.1g、MgSO40.1g、FeSO42mg、重鉻酸鉀10mg、瓊脂4g、水200ml操作流程：熱
8、水溶解淀粉→依次加入各無機試劑→混勻后加入瓊脂，熱水溶解→補充水分至所需體積→調(diào)pH至7.4-7.6由于實際操作時有配置好的培養(yǎng)基固體粉末，所以將各種培養(yǎng)基粉末計算好質(zhì)量后，稱取并用定量自來水溶于錐形瓶中，混勻，編號，放入滅菌鍋中滅菌消毒，消毒完畢使培養(yǎng)液稍加冷卻后，倒平板，靜置使培養(yǎng)基凝固。2、植物葉片內(nèi)生菌的分離(1)采集新鮮植物葉片，要求
