豇豆根腐病病原分離鑒定及其核糖體rdna-its序列分析

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1、釘豆根腐病病原分離鑒定及其核糖體rDNA-ITS序列分析摘要:采用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的方法對(duì)采集自武漢的豇豆根腐病分離物進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明,菌株JGF形態(tài)學(xué)上為茄腐皮鐮孢菌;對(duì)JGF菌株的核糖體RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA-ITS)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定,并在GenBank中進(jìn)行了Blast搜索和比對(duì)分析,根據(jù)rDNA—ITS序列分析結(jié)果結(jié)合豇豆病株癥狀和病菌的形態(tài)學(xué)特征,認(rèn)為武漢地區(qū)豇豆根腐病的病原菌為茄腐皮鐮孢菌(Fusariumso1aniSch1.)關(guān)鍵詞:豇豆根腐?。恍螒B(tài)學(xué);分子鑒定;rDNA

2、—ITS分析;FusariumsolaniSch1.中圖分類號(hào):S436.43文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2011)24—5107-03PathogenyIsolationandIdentificationofCowpeaRootRotDiseaseandSequencingofRibosomalrDNA-ITSWURen—fengl,YANGShao-1i1,WANPeng2,HUANGWei2(1.WuhanInstituteofVegetab1eSciences,Wuhan430065,China2.I

3、nstituteofPlantProtectionandSoilScience,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430064,China)Abstract:Thefungaliso1ateJGFfromcowpearootrotdisease,whichwerecol1ectedfromWuhan,werestudiedmorphologicallyandmolecularly.TheresultsshowedthattheisolateJGFweremorphological

4、FusariumsolaniSch1.TherDNA—ITSgenesofisolateJGFwereamplifiedandsequenced.BasedontheB1astsearchandthealignmentanalysisinGenBankdatabasecombinedwithmorphologicalcharacters,thepathogenofcowpearootrotdiseasewasidentifiedasFusariumsolaniSch1.Keywords:cowpearootrotdiseas

5、e;morphology;molecu1aridentification;rDNA一ITSsequenceanalysis;FusariumsolaniSchl豇豆是我國(guó)主要蔬菜作物之一,其多季節(jié)、多模式、多花色和短周期栽培成為農(nóng)民增收的主導(dǎo)性蔬菜。湖北常年種植面積4萬hm2,武漢市豇豆種植面積約0.67萬hm2,作為“豇豆之鄉(xiāng)”的武漢市新洲區(qū)雙柳街,年種植約0.4萬hm2次。但是生產(chǎn)中,常因栽培管理不當(dāng)或環(huán)境條件的影響,造成病害的流行,特別是土傳病害。釘豆根腐?。–owpearoot)[1]是豇豆的一種典型的土傳病害,隨豇

6、豆種植年數(shù)的增加、面積的擴(kuò)大、品種的變化等,已成為豇豆上發(fā)病最重、危害最大、防治最困難的病害。本研宄從武漢地區(qū)豇豆種植區(qū)采集并分離發(fā)病豇豆根腐病病菌,并進(jìn)行鑒定,為后續(xù)的研宄提供基礎(chǔ)材料和條件。1材料與方法1.1標(biāo)本來源與病原菌的分離純化標(biāo)樣于2009年采自武漢市蔬菜科學(xué)研宄所試驗(yàn)基地。病原真菌的分離方法參照方中達(dá)[2]的植病研宄方法有關(guān)介紹,選取新發(fā)病豇豆植株莖基部的根頸作為分離材料,進(jìn)行常規(guī)組織分離,經(jīng)單孢純化、培養(yǎng)獲得單孢菌株。1.2致病性測(cè)定采用K0chps法將發(fā)病組織上分離到的病原菌純培養(yǎng)物(孢子)制成懸浮液(10

7、5?106個(gè)孢子/mL)。采用自然傷根浸孢子液接種植株。取生長(zhǎng)良好的無病豇豆苗,用無菌水將根頸部表面沖洗干凈,然后使根完全浸在孢子懸浮液中30min,接種后植株定植于裝有滅菌沙土的花盆中。每個(gè)菌株接種8株苗,3次重復(fù),以無菌水為對(duì)照。植株置于25°C下光照培養(yǎng)箱中,接種后每隔1?2d觀察1次。發(fā)病后,從病斑處再次分離病原菌,確認(rèn)致病菌。1.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定1.3.1PDA上的病菌形態(tài)特征觀察將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上,25°C恒溫培養(yǎng)。7d后觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài),制作玻片,光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特

8、征,并測(cè)量分生孢子的大小。1.3.2產(chǎn)孢表型觀察產(chǎn)孢表型的觀察采用濾紙片法。參照張?zhí)煊睿?]的方法,取濾紙剪成比載玻片稍小的長(zhǎng)方形,將中心挖一邊長(zhǎng)約10mm的方孔,滅菌后用無菌水潤(rùn)濕放于無菌載玻片上。挑取少量活化的菌絲塊均勻涂于濾紙中央方孔的邊緣,然后將載玻片置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中

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