外治法對實(shí)驗(yàn)性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中bfgf表達(dá)的影響.doc

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1、城市管理工作總結(jié)XX年，全市城市管理工作按照市委、市政府提目的：了解外治法對堿性成纖維細(xì)胞生長因子在實(shí)驗(yàn)性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)分布情況的影響，探討中醫(yī)外治法治療骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)理。方法：32只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、扶他林組和外治法組，采用股靜脈結(jié)扎方法造模成功后，治療1個(gè)月。用免疫組化SABC方法對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)滑膜bFGF的表達(dá)分布進(jìn)行觀察。結(jié)果：造模組24只動(dòng)物膝關(guān)節(jié)滑膜中bFGF免疫組化陽性率為92%,且外治法組表達(dá)強(qiáng)于扶他林組和模型組。正常組8只動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)滑膜中免疫組化為陰性。結(jié)論：外治法能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)

2、動(dòng)物膝關(guān)節(jié)滑膜bFGF的表達(dá)，從而為外治法治療骨性關(guān)節(jié)炎在細(xì)胞因子水平提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：骨性關(guān)節(jié)炎；外治法；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；滑膜骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,0A)是一種慢性關(guān)節(jié)病，又稱退行性關(guān)節(jié)病、增生性關(guān)節(jié)病等。其特征是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生原發(fā)性或繼發(fā)性退行性變，并在關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成。本病的病理變化以關(guān)節(jié)軟骨變性及軟骨下骨質(zhì)病變?yōu)橹?。中醫(yī)外治法治療0A有顯著療效［1-2］。堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠誘導(dǎo)外胚層和中胚層來源的細(xì)胞增殖和分化，具有強(qiáng)大的促有絲分裂的作用，且在軟骨損傷后的修復(fù)中有很重要的作用。

3、本實(shí)驗(yàn)通過檢測bFGF在兔關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)及分布，拭圖探討中醫(yī)外治法治療0A的機(jī)理。1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性新西蘭大耳白兔32只，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量?kg。實(shí)驗(yàn)試劑及儀器bFGF一抗、SABC試劑盒、DAB顯色盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；扶他林乳膠劑購自湖北省中醫(yī)醫(yī)院。熏洗中藥購自湖北武漢定康大藥房，方劑采用湖北省中醫(yī)醫(yī)院成方傷科熏洗湯。中藥組成：蕪活12g、獨(dú)活12g、桂枝10g、桑枝30g、伸筋草10g、透骨草10g、花椒10g、艾葉10g、五加皮12g、海桐皮12g、白笠10g、防風(fēng)10

4、goG6805-1型針灸治療儀為青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，湖北中醫(yī)學(xué)院針灸實(shí)驗(yàn)中心提供。2方法造模方法以結(jié)扎股靜脈的方法［3］造模，用％的戊巴比妥按3mg/kg劑量進(jìn)行耳緣靜脈麻醉。麻醉滿意后將家兔仰臥固定于兔臺上，四肢伸直。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均取右側(cè)下肢造模。右側(cè)股根部備皮、消毒，無菌條件下操作，用手指觸及腹股溝股動(dòng)脈搏動(dòng)處并以此為中心，做2cm縱行切口，切開皮膚、皮下組織，暴露股神經(jīng)血管束，分離股靜脈并進(jìn)行雙重結(jié)扎，在兩道結(jié)扎線間將股靜脈剪斷，縫合皮膚及皮下組織。術(shù)后每天肌注青霉素20萬U/只，共7d，以預(yù)防感染。分組及處理3

5、2只白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、扶他林組和外治法組，每組8只。正常組不做任何特殊處理。模型組造模成功后正常喂養(yǎng)，自由活動(dòng)。扶他林組用扶他林乳膠劑在患膝周涂抹均勻，輕揉3~5min。外治法組則用中藥熏蒸配合手法彈撥以及電刺激，每次熏蒸30min，手法彈撥20min，以膝關(guān)節(jié)周圍及股后側(cè)及小腿后側(cè)肌肉為主，配合伸膝關(guān)節(jié)。電刺激采用G6805-1型針灸治療儀，配用自制電極，主要刺激兔股前側(cè)及小腿后側(cè)肌肉及膝周穴位，引起兔患膝被動(dòng)屈伸達(dá)40°?50°為宜，主要以屈曲為主。以上兩組均造模成功、自由喂養(yǎng)8周后分別開始治療。治療4周后處死

6、動(dòng)物取標(biāo)本，標(biāo)本取出后用10%多聚甲醛固定，行石蠟切片。模型組和正常組均在相應(yīng)時(shí)間處死，取標(biāo)本做石蠟切片。檢測方法石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%的雙氧水室溫5?lOmin滅活內(nèi)源性酶?？乖瓱嵝迯?fù)。滴加5%BSA封閉液，20min(室溫下)。加入稀釋的bFGF一抗，lh(37°C)。加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，鏈霉親合素生物素過氧化酶溶液與DAB液，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木素復(fù)染封片觀察。其間每個(gè)步驟均用PBS沖洗5min3次。結(jié)果判定：在400倍高倍鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)外有無染色，未著色為陰性，淺棕黃色為弱陽性，中等棕黃色為陽性，

7、深棕黃色為強(qiáng)陽性。統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（士S）表示，組間差異比較采用q檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。3結(jié)果正常組免疫組化染色為陰性；模型組僅有部分細(xì)胞因子反應(yīng)陽性，部分為弱陽性，胞漿中有黃褐色的斑塊狀陽性物質(zhì)分布，但量較少，大部分細(xì)胞無著色，外治法組和扶他林組與正常組相比有所不同，胞漿中陽性物質(zhì)數(shù)量增多，陽性細(xì)胞增加。在400倍光鏡下每組選取10個(gè)典型視野，采用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫組化實(shí)驗(yàn)室麗IAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。具體結(jié)果見表1。表1各組bFGF平均光度均值的比較（略）

8、注：與外治法組比較沖<，**P<4討論bFGF最早由牛的腦垂體中提取，是由146個(gè)氨基酸組成的活性物質(zhì)，它對中胚層來源的細(xì)胞有明顯的促有絲分裂作用［4］。它的生物學(xué)功能有以下幾個(gè)方面：促進(jìn)新生血管形成；促進(jìn)軟組織損傷修復(fù)H足進(jìn)骨、軟骨組織損傷修復(fù)。現(xiàn)已證實(shí)在人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中bFGF關(guān)節(jié)內(nèi)注