重組人era蛋白的可溶性表達、 純化及生物學(xué)活性測定

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1、重組人Era蛋白的可溶性表達、純化及生物學(xué)活性測定：吳元明,張曉楠,邢小紅,張俊杰,陳南春,陳蘇民【摘要】　　目的:為了得到可溶性表達的人Era（hEra）蛋白,并檢測其生物學(xué)活性。方法:把人era的cDNA基因從pUC19質(zhì)粒亞克隆入表達質(zhì)粒pMALp2x中。pMALhEra轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1,用異丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達。結(jié)果:pMALhEra載體表達的融合蛋白是以可溶狀態(tài)存在,表達量占菌體總蛋白的23.9%。再利用直鏈淀粉親和色譜柱對表達的融合蛋白進行純化,接著用

2、因子X將融合部分切除,但切除后的hEra蛋白不穩(wěn)定,隨著時間的延長而被降解?；钚詼y定結(jié)果表明人Era蛋白能與GTP結(jié)合,并具有GTP酶的活性。結(jié)論:可溶性表達了人Era蛋白,并用體外實驗證實人Era蛋白是一種G蛋白,這對人era基因的功能研究具有重要意義?！娟P(guān)鍵詞】人Era可溶性表達生物活性測定　　[Abstract]AIM:ToprepareasolublehumanEra(hEra)proteinandtomeasureitsbioactivity.METHODS:HumaneracDNAge

3、nefrompUC19plasmididpMALp2x.pMALhEra.Thefusedproteinmadeup23.9%ofthetotalcelllysate.ItyloseaffinitychromotographyanddigestedentainedhEraproteine.TheactivityassayshoanEraproteincanbeexpressedinasolubleformandithasbeenprovedtobeakindofGproteinbytheexp

4、erimentsinvitro.Thestudyisimportanttofurtherresearchintothefunctionofhumaneragene.　　[KeyanEra;solubleexpression;bioactivityassay　　era基因是1986年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的,Era與人及酵母的Ras蛋白有部分相似之處,命名為大腸桿菌Ras樣（E.coliRaslike）基因[1]。era基因在原核生物中普遍存在,在真核生物如蠕蟲、小鼠、人、植物中也存在與細菌era高度同

5、源的基因。Era蛋白是小G蛋白家族的新成員,和其他小G蛋白不同的是,其羧基端含有一個KH結(jié)構(gòu)域。實驗發(fā)現(xiàn)Era蛋白可以特異地與16SrRNA結(jié)合[2],這可能與其含有的KH結(jié)構(gòu)域有關(guān)。Sharma等[3]通過電鏡技術(shù)在嗜熱棲熱菌細胞內(nèi)觀察到30S和Era蛋白的復(fù)合體,接著Inoue等[4]又利用細菌突變技術(shù)說明Era參與了細菌的核糖體生物合成。era是大腸桿菌中可以正常表達的基因,但表達水平極低。遺傳學(xué)實驗證實era基因與細胞周期和細胞分裂有關(guān),是細菌生存繁殖所必需的重要基因?！　￡愄K民等相繼克

6、隆了人及小鼠全長的eracDNA基因。人eracDNA基因全長約2.2kb,含長度為1038bp的開放讀框,編碼346氨基酸的蛋白質(zhì)。人Era（hEra）與大腸桿菌Era(eEra)蛋白全序列比較,有31%相同、53%相似。同樣,hEra也是由N端的GTPase結(jié)構(gòu)域和C端KH結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成。有報道稱哺乳動物的Era可能是一個凋亡調(diào)節(jié)因子[5],但其具體功能還不清楚。本研究我們旨在得到可溶性表達的人Era(hEra)蛋白,并檢測其生物學(xué)活性。　　1材料和方法　　1.1材料pMALp2x和TB1

7、菌種為本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶,異丙基硫代βD半乳糖苷(isopropylβDthiogalactopyranoside,IPTG),DL2000DNAmarker購自TaKaRa公司。DNA片段的回收試劑盒:NucleoTrapTMNucleicAcidpurificationKits購自CLONTECH公司。直鏈淀粉樹脂,麥芽糖結(jié)合蛋白（maltosebindingprotein,MBP）,BSA為NEB公司產(chǎn)品。α32PGTP為北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司產(chǎn)品。塑基薄層析片PEI

8、celluloseF購自MachereyNagel公司,硝酸纖維素膜購于華美公司?！　?.2方法　　1.2.1pMALhEra表達載體的構(gòu)建用BamHI和PstI兩個酶切位點將pUC19hEra中的hera基因片段亞克隆入pMALp2x載體,然后轉(zhuǎn)化TB1感受態(tài)細胞。挑取單個菌落,提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定,陽性質(zhì)粒命名為pMALhEra[6]?！　?.2.2人eracDNA基因在大腸桿菌中的表達將含重組表達質(zhì)粒pMALhEra的單個菌落接種于5mL含Amp的LB培養(yǎng)液,3