早孕外周血及蛻膜中nk細(xì)胞表型及t淋巴細(xì)胞亞群的變化

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1、早孕外周血及蛻膜中NK細(xì)胞表型及T淋巴細(xì)胞亞群的變化：肖敏,凌斌*,陳崢崢,周穎,程志祥,高宗俠,馮定慶【摘要】　　目的:檢測(cè)孕婦外周血及蛻膜中T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞表型,探討它們與母胎界面免疫耐受的關(guān)系。方法:收集20例早孕同一患者的蛻膜組織及外周血,密度梯度離心法分離出淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)兩組中NK細(xì)胞、T細(xì)胞含量及其表面分子CD16、NKG2A、NKG2D表達(dá)水平。結(jié)果:蛻膜自然殺傷（dNK）細(xì)胞占蛻膜淋巴細(xì)胞(57.15±4.0)%,外周血自然殺傷（pNK）細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞(11

2、.46±1.58)%;dNK細(xì)胞表面CD16的表達(dá)明顯低于pNK細(xì)胞,二者分別(10.3±3.9)%與(95.6±2.6)%(P<0.05);dNK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá)明顯高于pNK細(xì)胞,二者分別為(87.10±4.5)%與(27.5±4.2)%(P<0.01),dNK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)水平與外周血NK細(xì)胞相近,分別為(88.70±4.1)%與(93.10±3.6)%(P<0.05);蛻膜中的CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)低于外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞,二者分別為（13.70±1.0）%與(

3、15.85±2.4)%(P<0.05),蛻膜中CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯低于外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞,二者分別為（15.23±1.5）%與（18.85±1.73）%(P<0.01)。結(jié)論:妊娠期蛻膜中的NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞可能是同維持母胎界面的免疫耐受的重要原因?！娟P(guān)鍵詞】蛻膜NK細(xì)胞T細(xì)胞　　在人類妊娠過(guò)程中,胎兒是同種異基因產(chǎn)物,攜帶父系的異源MHCI類分子,卻能抵御母體免疫細(xì)胞的攻擊,這與經(jīng)典的移植免疫理論相矛盾[1]。雖然已經(jīng)提出幾個(gè)主要因素去解釋正常妊娠的免疫生物學(xué)和妊娠相關(guān)的合并

4、癥,但還是很局限。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),子宮蛻膜組織中含有的免疫細(xì)胞包括大顆粒淋巴細(xì)胞,NK細(xì)胞,蛻膜巨噬細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞以及少許B淋巴細(xì)胞,其中NK細(xì)胞含量最豐富,占全部蛻膜免疫細(xì)胞的70%～80%[2],其比率隨著妊娠的發(fā)展而改變。隨著胚胎的植入,蛻膜自然殺傷細(xì)胞（decidualnaturalkillercells,dNK）的數(shù)量明顯上升,它們聚集在胎盤(pán)部位的蛻膜處與侵入的滋養(yǎng)層細(xì)胞密切接觸并分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)母胎界面間的免疫平衡。dNK細(xì)胞通過(guò)影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和分化來(lái)控制胎盤(pán)的形成?；赿NK細(xì)胞的

5、功能和在胚胎植入早期的大量增殖并廣泛分布于滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入的底蛻膜,人們推測(cè)dNK細(xì)胞在維持母胎界面免疫平衡中起了重要作用。最近報(bào)道認(rèn)為NK的活性是由淋巴因子調(diào)節(jié)的,而激活的T細(xì)胞可以釋放淋巴因子調(diào)節(jié)NK的細(xì)胞毒活性。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)比較母胎界面處dNK,T與外周血NK,T表型及含量的變化,進(jìn)一步揭示母胎界面免疫耐受的調(diào)節(jié)機(jī)制。　　1材料和方法　　1.1材料在我院計(jì)劃生育門(mén)診2006-05/2007-0120例要求人工流產(chǎn)、孕6～8周的正常妊娠婦女,平均年齡（25.2±5.2）歲,既往月經(jīng)規(guī)則,無(wú)病理妊娠史,此

6、次妊娠期間無(wú)陰道異常出血,B超檢查提示胚胎發(fā)育正常,有胚囊、胚芽及心血管搏動(dòng)。人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購(gòu)自上海華精生物有限公司;不同熒光素標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體（mAb）(CD3FITC、CD3CY、CD4FITC、CD8PE、CD56CY、CD56PE、CD16FITC)購(gòu)自BDPharmigen公司;澡紅蛋白標(biāo)記的鼠抗人mAb(NKG2APE、NKG2DPE)購(gòu)自RD公司;FACS檢測(cè)儀為BDFACECalibur公司產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1標(biāo)本采集經(jīng)患者同意,人工流產(chǎn)

7、術(shù)之前接上無(wú)菌負(fù)壓吸引瓶,取患者蛻膜組織,置于盛有冰預(yù)冷的1×PBS離心管中。迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,在超凈臺(tái)內(nèi)將新鮮蛻膜組織用PBS洗2、3次,除去血凝塊,小心去除蛻膜組織中絨毛組織?！　?.2.2蛻膜和外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離將洗凈的蛻膜組織用眼科小剪刀剪切成1mm左右的組織塊,置于120目銅網(wǎng)中,4℃PBS沖洗,用1次性注射器橡皮頭研磨,將濾液再通過(guò)100目銅網(wǎng),離心濃縮后溶于RPMI1640培養(yǎng)液,以1∶1體積比平鋪于Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上,2000r/min離心25min,緩慢增速,無(wú)制動(dòng)停轉(zhuǎn),取出中間

8、層淋巴細(xì)胞層,PBS洗滌2次,20g/L臺(tái)酚藍(lán)排除法測(cè)活細(xì)胞>90%,調(diào)細(xì)胞密度為1×109/L?！　?.2.3外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血加入等體積的PBS稀釋,然后以1∶1比例沿管壁緩慢加在淋巴細(xì)胞分離液液面上,2000r/min離心20min,吸取淋巴細(xì)胞層。用PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞密度1×109/L,20g/L臺(tái)酚藍(lán)排除法測(cè)活細(xì)胞>90%。　　1.2.4FCM檢測(cè)細(xì)胞表面分子取