犬瘟熱、犬細(xì)小病毒二重實時熒光定量pcr檢測方法的建立及應(yīng)用

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1、第1章犬瘟熱、犬細(xì)小病毒二重實時焚光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用1.1材料l.i.i菌(毒〉株及樣品92份已知CDV/CPV陰性的犬糞便均由河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室保存；48份臨床疑似樣品采自鄭州某寵物門診。1.1.2主要試劑磁珠法核酸全自動提取試劑盒購自Ambion^物科技公司；TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0冋收試劑盒、dNTPs、DNA聚合酶等均購自寶生物工程(大連)冇限公司；JM109感受態(tài)細(xì)胞、pGEM-TEasy載體、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑均購tlProm

2、ega公司；Trizol試劑購自GibcoRBL公司。1.1.3主要儀器設(shè)備實時熒光定量PCR儀(ABI7000)購自美國ABI公司；PCR擴增儀購自徳國Biometra公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國AlphaInnotech公司；KingFisher令自動核酸提取儀購自美國Thermo公司；紫外分光光度計(UV-2450)購自日本島津公司；臺式高速冷凍離心機購自美國Heraeus公司；恒溫水浴鍋購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。1.1.4常用溶液和培養(yǎng)基(4)TE緩沖液(1L)量取100mllmol/LTris-Hcl緩沖液，20ml500mmo

3、l/LEDTA置于IL燒杯中，向燒杯中加入約800ml的滅菌水溶解混勻，并將溶液定容至1L,之后高溫高壓滅菌，保存于室溫環(huán)境。(6)50xTAEBuffer(200ml)稱量48.4gTris，7.44gNa2EDTA.2H2O于200ml燒杯中，加入約100ml滅菌水，充分溶解混勻，加入11.42ml的乙酸，混勻，加入滅菌水定容至200ml后，于室溫環(huán)境保存。(7)IPTG(10ml)稱量0.24gIPTG置于10ml離心管中，加入5ml滅菌水溶解混勻后定容至10ml,然后用0.22pm細(xì)菌濾器對混合液過濾除菌，適量分裝后，于-20°C保存。(6)

4、X-Gal(10ml)稱量0.2gX-Gal置于10ml離心管中。加入8mlDMF溶液，溶解混勻后定容至10ml,適量分裝后，于-20°C避光保存。1.2方法1.2.1pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備采取同樣方法提取CPV細(xì)胞培養(yǎng)物、正常FK81細(xì)胞、CPV臨床陽性樣品、臨床疑似CPV感染的犬唾液、糞便等待檢樣品、CAV-1、CAV-2、無CDV/CPV感染的健康犬幾便的總DNA。核酸提取按照Ambion生物科技公司磁珠法核酸全自動提取試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作如下：取96孔（12x8）核酸提取板，每一列自上而下依次標(biāo)記

5、為A->F孔，按照操作說明書，對每一孔所添加試劑及待檢樣品的量如下表所示：（2）總RNA的反轉(zhuǎn)錄置于37°C恒溫水浴鍋反應(yīng)1h，結(jié)束后，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于后續(xù)試驗或-20°C保存?zhèn)溆?。?）目的片段的PCR擴增將反轉(zhuǎn)錄的CDVcDNA取2叫加入CDVPCR體系中，PCR體系總體積為25

6、iL,各成分如下：加入到CPVPCR體系中，PCR體系總體積為25pL，各成分如下：最后72°C延伸lOmin,取出擴增產(chǎn)物用于凝膠電泳分析。（4）擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析①凝膠的配置：按照所需濃度，以lxTAE電泳緩沖液配置凝膠液，微波爐加熱使完全溶解。待冷卻

7、到60°C左右加入核酸染色劑GoldView（至終濃度力5（ig/ml）,趁熱倒入模具，凝膠厚度在0.4?0.7cm之間，大約20min后，凝膠凝固，小心拔出梳子，將平板放入電泳槽中。②樣：向樣pTj中加入適量6>

8、7?10V/cm之間，當(dāng)GoldView電泳至適當(dāng)位置（約15min）,關(guān)閉電源，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。（5）目的片段的回收及鑒定根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0試劑盒說明？5，進(jìn)行目的片段的回收：①用干凈的手術(shù)刀片將455bp片段和559bp片段的目的片段瓊脂凝膠(1%)切下，放入己稱過重量的離心管中，進(jìn)行二次稱重，計算凝膠塊凈重。②按lmg膠快=1(iL進(jìn)行換算，將凝膠塊搗碎并加入3倍體職的BufferGM溶液。③在室溫15?25°C條件下，采

9、用間斷振蕩混合法，使膠塊充分融化。(6)回收的目的片段與pGEM-TEasy載體的連接根據(jù)Promcga公司