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1、等位基因特異性申徐良陳方平魏武張梅香史文芝秦小琪徐洪亮【摘要】目的：建立敏感特異的JAK2V617F點(diǎn)突變的臨床檢測(cè)方法。方法：基因組DNA從HEL細(xì)胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特異性-PCR（Allelespecific-PCR，AS-PCR）和限制性內(nèi)切酶消化的方法檢測(cè)基因組中JAK2V617F突變。結(jié)果：本AS-PCR法可對(duì)JAK2基因擴(kuò)增出364bp的內(nèi)參照條帶，當(dāng)存在JAK2V617F突變時(shí)，又可以擴(kuò)增出203bp的突變條帶。只有野生型內(nèi)參照條帶364bp可被BsaXⅠ消化切割。結(jié)論：AS－
2、PCR法和限制性內(nèi)切酶法是檢測(cè)JAK2V617F突變的敏感特異的檢測(cè)方法，可以成功應(yīng)用于臨床檢測(cè)?！娟P(guān)鍵詞】等位基因特異性-PCR；JAK2V617F突變；限制性內(nèi)切酶BsaXⅠAbstractObjective:ToestablishasensitiveandspecifictestforJAK2V617Fpointmutation.Methods:GenomicDNAHELcellsorPeripheral-bloodcellsfromnormalvolunteer.Allele-specificpolyme
3、rasechainreactions(AS-PCR)andrestrictionenzymedigestionedtodetectthemutationingenomicDNA.Results:Acontrolband(364bp)canbeobtainedbyAS-PCR,andamutedband(203bp)canbeobtainedonlyeBsaXⅠ.Conclusion:AS-PCRandrestrictionenzymedigestionutation,andcanbesuccessfullyuse
4、dforclinicaltest.Keyutation;RestrictionenzymeBsaXⅠJAK2基因?qū)貸AKs(Januskinases/Justanotherkinases)家族成員，是胞漿非受體性酪氨酸激酶,在多種造血生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔１〕。2005年，Baxter〔２〕和Kralovucs〔３〕先后發(fā)現(xiàn)大部分骨髓增殖性疾病患者攜帶有一個(gè)獲得性的JAK2基因突變-JAK2V617F，該基因突變位于JAK2基因第1849位，原來的鳥嘌呤（G）被胸腺嘧啶（T）所取代，導(dǎo)致原位于617
5、位的纈氨酸錯(cuò)義編碼為苯丙氨酸(G→T,JAK2V617F)。該突變的陽(yáng)性率在PV中高達(dá)65%～97%、ET為23%～57%和IMF為35%～57%，在AML/CML中有少量表達(dá)〔２～6〕。JAK2V617F基因突變的發(fā)現(xiàn)是近年來骨髓增殖性疾病發(fā)病機(jī)制的突破性進(jìn)展，因此有學(xué)者將其稱為骨髓增殖性疾病的“JAK2時(shí)代”。JAK2V617F的發(fā)現(xiàn)對(duì)于臨床上骨髓增殖性疾病的診斷和鑒別診斷有非常重要的意義。為此，我們?cè)谂R床上建立了兩種敏感特異的JAK2V671F點(diǎn)突變的檢測(cè)方法－等位基因特異性－PCR法（Allelespec
6、ific-PCR，AS-PCR）和限制性內(nèi)切酶消化法。這兩種方法的應(yīng)用，有利于提高骨髓增殖性疾病的臨床診斷水平。1材料與方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)HEL細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上?？茖W(xué)研究院，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Hyclone)、100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至>80%匯合時(shí)以1∶3的比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)。1.2基因組DNA制備HEL細(xì)胞基因組和正常人血液基因組DNA用血液
7、基因組提取試劑盒（上海生物工程公司產(chǎn)品）提取。1.3AS-PCR及產(chǎn)物分析PCR引物合成工作由北京奧科生物公司完成。各引物序列如下：公用反向引物(R1)5＇-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3＇、野生型正向引物(F1)5＇-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3＇（364bp）、突變特異性正向引物(F2)5＇-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3＇（203bp）。PCR反應(yīng)體系為50μL,每管中加入80ngDNA模板，公用反向引物
8、(10μM)1μL，突變特異性正向引物(10μM)1μL或野生型正向引物(10μM)1μL，10XPCR緩沖液5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTPs1μL，5U/μL的Taq聚合酶1μL，最后用去離子水補(bǔ)足50μL。置于MJResearchPTC-100基因擴(kuò)增儀中按以下程序擴(kuò)增:先94℃變性11min,然后進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，包括變性40s（94℃）、退火1mi
