等位基因特異性pcr在ace基因多態(tài)性檢測中應(yīng)用

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1、等位基因特異性PCR在ACE基因多態(tài)性檢測中應(yīng)用【摘要】目的：采用等位基因特異性PCR法對ACE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，并對腦血管疾?。–VD）與ACE基因多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行探討。方法：將2010年2月-2013年2月云南景頗族和傣族共73例CVD患者（CVD組）和43例健康人員（對照組）進(jìn)行ACE基因多態(tài)性檢測，并對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：116例受檢人員均獲得擴增產(chǎn)物，CVD組患者73例擴增產(chǎn)物中，DD型14例（19.2%）,II型30例，ID型29例；對照組43例擴增產(chǎn)物中，DD型5例（11.6%）,II型19例，ID型19例，對照組中DD型基因頻率低于CVD組，差異無統(tǒng)

2、計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：等位基因特異性PCR檢測技術(shù)可對ACE基因多態(tài)性進(jìn)行有效檢測，對于CVD的防治具有重要的參考意義?！娟P(guān)鍵詞】等位基因特異性PCR；腦血管疾?。籄CE基因多態(tài)性中圖分類號R743文獻(xiàn)標(biāo)識碼B文章編號1674-6805（2013）34-0042-02腦血管疾病（cerebrovasculardisease,CVD）由腦血管病變所引起，主要高發(fā)于65歲以上人群，患者發(fā)病后易殘留后遺癥，導(dǎo)致勞動和生活能力喪失，也是人類死亡的重要原因之一。CVD主要分為缺血性腦血管病和出血性腦血管病，其中以缺血性為多見。CVD的產(chǎn)生由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所引

3、起，髙血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病是CVD發(fā)生的首要高危因素［1］,而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因多態(tài)性與高血壓等心血管疾病的發(fā)生有關(guān)［2］。筆者選擇等位基因特異性PCR技術(shù)對云南景頗族和傣族73例CVD患者的ACE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，以期為ACE基因多態(tài)性與CVD的相關(guān)性提供臨床依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1資料與方法1.1一般資料選取2010年2月-2013年2月云南景頗族和傣族46例健康人員（對照組）和73例CVD患者（CVD組），取早晨空腹靜脈血10ml,肝素抗凝后離心分離血漿，采用酚抽提法抽提患者外周血白細(xì)胞DNA模板,所有受檢人員無血緣關(guān)系。1.2試劑與儀

4、器DNA提取試劑選用天根DP-318DNA提取試劑盒；Taqmaster等PCR反應(yīng)試劑購自天根生化科技有限公司；引物由捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，ACE-F,5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3',ACE-R,5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'；PCR儀選用Icyclertmthermalcycler（美國Bio-RAD公司）；微量核酸蛋白定量儀選用ND~1000UV/Vis（美國NanoDrop公司）；凝膠成像系統(tǒng)選用UniversalHoodll（美國Bio-RAD公司）。1.3方法1.3.1模板DNA提取在

5、全血樣品中加入Prok20?1,完全混合、離心，再加入GB200ul,離心后加無水乙醇，充分混合后過柱，棄濾液，加入TB50n1,過柱后回收TB定量，并對DNA樣品進(jìn)行含量檢測。1.3.2PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴增體系：ACE-F或ACE-R引物1.5Hl,H207.5n1（樣品），2XTaq-master10Pl,DNA樣品1uloPCR擴增條件：94°CX4min預(yù)變性，94°CX30s變性，67°CX30s退火，72°CX30s延伸，共28?31個循環(huán)，72°CX4min延伸后保存。采用凝膠成像系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析，所有樣品的PCR實驗以及電泳分析均重復(fù)兩次以

6、上以對結(jié)果進(jìn)行驗證。1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x土s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（％）表示，等位基因頻率差異采用字2檢驗，P0.05）,所有樣品均經(jīng)兩次以上PCR及電泳驗證，條帶均清晰且結(jié)果一致（圖1）。DL2000490bp（II型）190bp（DD型）（ID型）100bpDNALadder圖1ACE基因多態(tài)性等位基因特異性PCR檢測結(jié)果3討論腦血管疾病(CVD)是65歲以上人群的常見疾病，當(dāng)患者腦部出現(xiàn)梗阻性缺血時即發(fā)生缺血性CVD,而當(dāng)腦部血管發(fā)生破裂時則為出血性CVD,患者易致殘致死，喪失工作

7、或生活能力，危險性極高［3］。有研究表明，腦血管疾病的發(fā)生與高血壓、高血脂、高血糖、冠心病等心血管疾病密切相關(guān)，而ACE基因中由Alu重復(fù)序列的存在或缺失的三種基因型(缺失純合子DD,插入純合子II,雜合子ID)與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)［4］。因此，鑒于CVD的高發(fā)性和危害性，ACE基因多態(tài)性的檢測對于CVD疾病的防治具有重要的意義。在本次研究中，116例受檢人員均成功得到擴增產(chǎn)物，且經(jīng)驗證結(jié)果一致。在CVD組73例患者的擴增產(chǎn)物中，DD型14例，基因頻率19.2%；對照組43例患者的擴增產(chǎn)物中，DD型5例，基因頻率11.6%,明顯低于CV