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《應(yīng)用等位基因特異性pcr檢測nppb基因突變》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、應(yīng)用等位基因特異性PCR檢測NPPB基因突變1.貴陽中醫(yī)學(xué)院貴州貴陽550000；2.海南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室海南?？?71199；3.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院海南海口570102；4.海南省中醫(yī)院海南海口570000【摘要】目的：建立NPPB基因RS3753581突變位點(diǎn)的等位基因特異性PCR技術(shù)。方法:應(yīng)用針對NPPB基因RS3753581突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的等位基因特異性PCR技術(shù)，對海南黎族人群中NPPB基因RS3753581突變位點(diǎn)類型進(jìn)行了基因分型檢測,同時對經(jīng)上述等位基因特異性PCR檢測分型的樣木進(jìn)行序列測定。結(jié)果：在海南黎族人群中,RS
2、3753581突變位點(diǎn)可檢測出NN、NM、MM3種基因型，用等位基因特異性PCR技術(shù)鑒定的NPPB基因RS3753581突變位點(diǎn)基因分型結(jié)果與序列測定結(jié)果完全符合。結(jié)論：等位基因特異性PCR技術(shù)操作簡便，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可作為鑒定NPPB基因RS3753581突變位點(diǎn)的可行方法?！娟P(guān)鍵詞】NPPB基因；等位基因特異性PCR;基因分型【中圖分類號1R746.4【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1674-8999(2015)6-0151-02筆者應(yīng)用簡便、快速的PCR技術(shù)檢測NPPB基因RS3753581突變的等位基因特異性，討論探索海南黎族人群中
3、NPPB基因RS3753581位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果報告如下。1材料與方法1.1DNA樣品從海南省陵水黎族自治縣醫(yī)院隨機(jī)釆集海南籍黎族正常人群且血緣上無關(guān)個體的血液樣木219份，用EDTA抗凝、SDS方法提取DNA。1.2等位基因特異性PCR擴(kuò)增NPPB基因1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成從NCBI中獲得人類NPPB基因的兩個突變位點(diǎn)上下游500bp的基因序列，用PRIMER5.0軟件輔助設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。RS3753581位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)（G→T）,3581-1（上游通用引物）：5′-GGGTGGT
4、CAGATGAAGGA-3′（Tm值：52.4°C）,3581-N（下游正常引物）：5’-AGCCTGGTTGACAGACAGC-3’（Tm值：57°C）,3581-M（下游突變引物）：5’-AGCCTGGTTGACAGAGTGA-3’（Tm值：58°C）,引物片斷長度均為165bp。測序產(chǎn)物擴(kuò)增引物序列，RS3753581位點(diǎn)引物，3581-1上游引物設(shè)計(jì)（G→T）:5′-gggTggTCAgATgAAggA-3′（Tm值：52.4°C）,358
5、1-2（下游引物），5′-ggTCCAgTgATgACgAAgT-3′（Tm值:51.9°C）,片段長度為512bp。1.2.2PCR擴(kuò)增每個多態(tài)位點(diǎn)均設(shè)立2個PCR檢測管，分別加入寡核苷酸正常和突變引物用于檢測每個多態(tài)位點(diǎn)正常和突變的等位基因。反應(yīng)體系如下:每管在l×PCR緩沖液（10mmol/LTris-HCI,pH8.3,50mmol/LKCI,1.5?2.0mmol/LMgCI2）中含模板DNA0.2μg,引物各0.2?0.5μmol/L,,4種dNTP各200μmol/L,Ta
6、qDNA聚合酶（北京天根公司產(chǎn)品）1U。PCR循環(huán)參數(shù)為：首先在94°C進(jìn)行5min的熱變性，隨后進(jìn)行38個循環(huán)反應(yīng)（每個循環(huán)包括94°C50s,60°C50s,72°Cl0min）o擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色在UVIband凝膠成像系統(tǒng)（英國UVItec公司產(chǎn)品）中觀察結(jié)果并照相。1.3NPPB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的DNA序列測定隨機(jī)抽取經(jīng)上述建立的等位基因特異性PCR技術(shù)檢測后分型出的各種NPPB基因型的DNA樣本，將3581-1和3581-2-2引物對的PCR擴(kuò)增特異DNA片段，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行D
7、NA序列測定。2結(jié)果2.1NPPB基因RS3753581突變位點(diǎn)的基因分型結(jié)果每種NPPB基因突變位點(diǎn)都利用突變型引物和野生型引物同吋進(jìn)行兩管PCR擴(kuò)增，根據(jù)每個樣品兩種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，可準(zhǔn)確判定樣品的基因類型。應(yīng)用建立的等位基因特異性PCR技術(shù)對219例海南黎族人樣本DNA進(jìn)行了NPPB基因的檢測。在黎族人群中，RS3753581突變位點(diǎn)可檢測出NN、MMM、MM3種基因型。2.2NPPB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的DNA測序驗(yàn)證測序結(jié)果表明等位基因特異性PCR技術(shù)對NPPB基因的分型結(jié)果與DNA測序結(jié)果相符，說明基因分型結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確
8、率均較高。3討論NPPB基因存在于1號染色體短臂的末端［1］,包括3個外顯子和2個內(nèi)顯子。NPPB基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)生成BNP前體原，脫去信號肽后生成含108個氨基酸的BNP前體
