等位基因特異性pcr在ace基因多態(tài)性檢測中應(yīng)用

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1、等位基因特異性PCR在ACE基因多態(tài)性檢測中應(yīng)用【摘要】目的:采用等位基因特異性PCR法對ACE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測,并對腦血管疾?。–VD)與ACE基因多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行探討。方法:將2010年2月-2013年2月云南景頗族和傣族共73例CVD患者(CVD組)和43例健康人員(對照組)進(jìn)行ACE基因多態(tài)性檢測,并對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果:116例受檢人員均獲得擴(kuò)增產(chǎn)物,CVD組患者73例擴(kuò)增產(chǎn)物中,DD型14例(19.2%),II型30例,ID型29例;對照組43例擴(kuò)增產(chǎn)物中,DD型5例(11.6%),II型19例,ID型19例,對照組中DD型基因頻率低于CVD組,差異無統(tǒng)

2、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:等位基因特異性PCR檢測技術(shù)可對ACE基因多態(tài)性進(jìn)行有效檢測,對于CVD的防治具有重要的參考意義?!娟P(guān)鍵詞】等位基因特異性PCR;腦血管疾??;ACE基因多態(tài)性中圖分類號R743文獻(xiàn)標(biāo)識碼B文章編號1674-6805(2013)34-0042-02腦血管疾?。╟erebrovasculardisease,CVD)由腦血管病變所引起,主要高發(fā)于65歲以上人群,患者發(fā)病后易殘留后遺癥,導(dǎo)致勞動(dòng)和生活能力喪失,也是人類死亡的重要原因之一。CVD主要分為缺血性腦血管病和出血性腦血管病,其中以缺血性為多見。CVD的產(chǎn)生由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所引

3、起,髙血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病是CVD發(fā)生的首要高危因素[1],而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因多態(tài)性與高血壓等心血管疾病的發(fā)生有關(guān)[2]。筆者選擇等位基因特異性PCR技術(shù)對云南景頗族和傣族73例CVD患者的ACE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測,以期為ACE基因多態(tài)性與CVD的相關(guān)性提供臨床依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1資料與方法1.1一般資料選取2010年2月-2013年2月云南景頗族和傣族46例健康人員(對照組)和73例CVD患者(CVD組),取早晨空腹靜脈血10ml,肝素抗凝后離心分離血漿,采用酚抽提法抽提患者外周血白細(xì)胞DNA模板,所有受檢人員無血緣關(guān)系。1.2試劑與儀

4、器DNA提取試劑選用天根DP-318DNA提取試劑盒;Taqmaster等PCR反應(yīng)試劑購自天根生化科技有限公司;引物由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成,ACE-F,5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3',ACE-R,5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3';PCR儀選用Icyclertmthermalcycler(美國Bio-RAD公司);微量核酸蛋白定量儀選用ND~1000UV/Vis(美國NanoDrop公司);凝膠成像系統(tǒng)選用UniversalHoodll(美國Bio-RAD公司)。1.3方法1.3.1模板DNA提取在

5、全血樣品中加入Prok20?1,完全混合、離心,再加入GB200ul,離心后加無水乙醇,充分混合后過柱,棄濾液,加入TB50n1,過柱后回收TB定量,并對DNA樣品進(jìn)行含量檢測。1.3.2PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴(kuò)增體系:ACE-F或ACE-R引物1.5Hl,H207.5n1(樣品),2XTaq-master10Pl,DNA樣品1uloPCR擴(kuò)增條件:94°CX4min預(yù)變性,94°CX30s變性,67°CX30s退火,72°CX30s延伸,共28?31個(gè)循環(huán),72°CX4min延伸后保存。采用凝膠成像系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,所有樣品的PCR實(shí)驗(yàn)以及電泳分析均重復(fù)兩次以

6、上以對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示,比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,等位基因頻率差異采用字2檢驗(yàn),P0.05),所有樣品均經(jīng)兩次以上PCR及電泳驗(yàn)證,條帶均清晰且結(jié)果一致(圖1)。DL2000490bp(II型)190bp(DD型)(ID型)100bpDNALadder圖1ACE基因多態(tài)性等位基因特異性PCR檢測結(jié)果3討論腦血管疾病(CVD)是65歲以上人群的常見疾病,當(dāng)患者腦部出現(xiàn)梗阻性缺血時(shí)即發(fā)生缺血性CVD,而當(dāng)腦部血管發(fā)生破裂時(shí)則為出血性CVD,患者易致殘致死,喪失工作

7、或生活能力,危險(xiǎn)性極高[3]。有研究表明,腦血管疾病的發(fā)生與高血壓、高血脂、高血糖、冠心病等心血管疾病密切相關(guān),而ACE基因中由Alu重復(fù)序列的存在或缺失的三種基因型(缺失純合子DD,插入純合子II,雜合子ID)與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。因此,鑒于CVD的高發(fā)性和危害性,ACE基因多態(tài)性的檢測對于CVD疾病的防治具有重要的意義。在本次研究中,116例受檢人員均成功得到擴(kuò)增產(chǎn)物,且經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果一致。在CVD組73例患者的擴(kuò)增產(chǎn)物中,DD型14例,基因頻率19.2%;對照組43例患者的擴(kuò)增產(chǎn)物中,DD型5例,基因頻率11.6%,明顯低于CV

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