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1、歐洲型PRRSV重組腺病毒疫苗的構(gòu)建效果評(píng)價(jià) 豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome Virus，PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)疾病。目前該病在全球范圍廣泛流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。目前根據(jù)PRRSV基因型和抗原性差異可分為2個(gè)基因型，分別是歐洲型(基因Ⅰ型，代表株為L(zhǎng)V株)和美洲型(基因Ⅱ型，代表株為VR-233
2、2)。一直以來，我國(guó)主要流行株為美洲型及其變異株，但如今歐洲型PRRSV的流行已經(jīng)打破了地域的限制，近年來相繼在福建，香港、內(nèi)蒙古等地分離到歐洲型PRRSV。而該病曾在歐洲大規(guī)模流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，因此對(duì)歐洲型PRRSV的預(yù)防顯得愈加重要。目前防控歐洲型PRRSV感染的商品化疫苗僅有滅活疫苗，但其免疫效果不十分理想，只能提供部分保護(hù)，不能預(yù)防感染。因此凾待研發(fā)一種新型有效的疫苗?！ ∠俨《据d體在基因治療和疫苗生產(chǎn)中顯示了較好的應(yīng)用前景，其具有宿主范圍廣，病毒滴度高，可插入較大的外源基因片段且不整合到宿主基因組等特點(diǎn)
3、，是一種應(yīng)用廣泛的基因治療載體。本研究以歐洲PRRSV LV株ORF3、ORF5基因?yàn)閷?duì)象，以人腺病毒五型為載體，構(gòu)建重組腺病毒，并通過小鼠試驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫原性?！ 〔牧吓c方法 1 材料 1.1 基因、質(zhì)粒及細(xì)胞株 PRRSV LV株ORF3、ORF5基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成;人腺病毒五型野毒(Adenovirus 5公司;轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP購(gòu)自瑞士Roche公司;DMEM及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;膠回收試劑盒和基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen Biosciences
4、公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?！ ? 方法 2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)PRRSV LV株ORF3、ORF5基因組序列，應(yīng)用Prime 5.0設(shè)計(jì)6條引物，其中引物ORF3-R(D-18TVector(于孵育器中16℃連接過夜)，構(gòu)建克隆質(zhì)粒18T-EU-ORF3、18T--EU-ORF5和18T-EUORF3-ORF5并轉(zhuǎn)化至DH5α，而后小提質(zhì)粒并測(cè)序?！ ?.3 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 將構(gòu)建的18T-EU-ORF3、18T-EU-ORF5和18T-EU-ORF3-ORF5分別與穿梭質(zhì)粒pacad5K-N pa以
5、BamHⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/NotⅠ、BamHⅠ/NotⅠ進(jìn)行雙酶切，然后在T4DNA連接酶作用下連接、轉(zhuǎn)化，小提質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證?！ ?.4 質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染 將構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒用PacⅠ酶切線性化后，以2μg質(zhì)粒與2μl Xtreme GENE DNA轉(zhuǎn)染試劑、200μl OPTI-MEM混勻后共轉(zhuǎn)染至80%的HEK 293單層細(xì)胞中，1h后補(bǔ)加10%DMEM，于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，收集出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的HEK 293細(xì)胞。 2.5 重組腺病毒GP3、GP5、GP3-G
6、P5目的蛋白I-2640調(diào)整細(xì)胞濃度為2106個(gè)/ml，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加50μl淋巴細(xì)胞(含1105個(gè)淋巴細(xì)胞)，并分別加入50μl Con A、50μl(1MOI)PRRSV滅活病毒及50μl RPMI-1640作為非特異性刺激組、特異性刺激組與不加刺激物的對(duì)照組，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，每孔加入10μl(5mg/ml)蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，而GP5蛋白含有豐富的糖蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。同時(shí)GP3、GP4、GP5、M蛋白存在潛在的T細(xì)胞表位。這
7、對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的PRRSV抗體極為重要。基于此因素，為預(yù)防PRRSV的感染，人們致力于亞單位疫苗的研發(fā)。Chia等報(bào)道重組桿狀病毒表達(dá)的GP3-GP5蛋白可對(duì)妊娠母豬提供68%的保護(hù)率。Jiang等以腺病毒為載體共表達(dá)的GP3-GP5，GP4-GP5，GP3-GP4-GP5免疫小鼠，結(jié)果均可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體，但僅限于小鼠免疫實(shí)驗(yàn)。而以重組雞痘病毒為載體，共表達(dá)IL-18-ORF5-ORF3，無論是中和抗體還是淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，均顯示出較好的免疫原性?！ ∠俨《疽呀?jīng)被廣泛研究60余年，人們也了解和掌握了它的許多生物
8、學(xué)特性，而以復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的重組疫苗在細(xì)胞內(nèi)均能高水平表達(dá)所連接的目的基因。正因如此，臨床試驗(yàn)中腺病毒載體作為一種常用載體系統(tǒng)被用于遞送外源基因。大多數(shù)腺病毒載體缺失E1區(qū)，由于E1區(qū)的缺失，使得載體在細(xì)胞系內(nèi)不能復(fù)制。研究表明E1區(qū)缺失的腺病毒載體更適用于體內(nèi)外的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。E2蛋白介導(dǎo)病毒DN
