dpc4基因在肺癌中的表達(dá)及其與微血管形成和凋亡

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1、DPC4基因在肺癌中的表達(dá)及其與微血管形成和凋亡【摘要】目的探討DPC4(deletedinpancreaticcarcinomalocus4，DPC4)基因在非小細(xì)胞肺癌(nonsmallcelllungcarcinoma,NSCLC)中的表達(dá)及其與微血管形成和凋亡的關(guān)系。方法利用免疫組織化學(xué)SP法檢測52例NSCLC組織、19例相應(yīng)的癌旁正常肺組織中DPC4、VEGF的表達(dá)，用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)算微血管密度MVD值，應(yīng)用TUNEL技術(shù)對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了檢測并計(jì)算凋亡指數(shù)。結(jié)果DPC4在肺癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)率為63.5%(33/52)，與癌

2、旁正常肺組織中的陽性表達(dá)率89.5%(17/19)相比，DPC4陽性表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;DPC4與組織學(xué)類型、腫瘤細(xì)胞分化程度無關(guān)（P＞0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05）。52例NSCLC中，DPC4的表達(dá)與VEGF、MVD值均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.303,P=0.020)。DPC4陽性組凋亡指數(shù)(apoptoticindex,AI)值明顯高于DPC4陰性組（P<0.05）。結(jié)論DPC4的低表達(dá)可能是肺癌發(fā)生過程的早期事件，并可通過直接或間接的作用促進(jìn)肺癌血管生成，從而促進(jìn)肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，DPC4的高表達(dá)可能促進(jìn)

3、細(xì)胞的凋亡。【關(guān)鍵詞】DPC4肺癌免疫組化血管生成凋亡0引言DPC4(deletedinpancreaticcarcinomalocus4，DPC4)是一種新的腫瘤抑制基因，其首先由HahnSA等[1]于1996年在Science上報(bào)道，其蛋白產(chǎn)物Smad4是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超家族受體的直接底物，而TGFβ具有抑制細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種功能[2]，最近的研究顯示DPC4除了在TGFβ信號傳導(dǎo)途徑中的中心作用以外，還具有一些獨(dú)立于TGFβ的功能。如DPC4具有調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和侵入的潛在功能，以及抑制腫瘤組織的血管增殖和促進(jìn)凋亡等[3]。但DPC4在NS

4、CLC中的表達(dá)尤其與腫瘤微血管形成和凋亡的關(guān)系，國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道甚少。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測了52例肺癌組織和19例相應(yīng)的癌旁正常組織DPC4基因的蛋白表達(dá)，以探討其在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用及其與微血管形成和凋亡的關(guān)系，為今后以DPC4基因?yàn)榘悬c(diǎn)對肺癌進(jìn)行基因治療提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1標(biāo)本標(biāo)本來自湖北省腫瘤醫(yī)院和武漢大學(xué)附屬醫(yī)院2000年3月至2003年7月肺癌手術(shù)患者52例，其中鱗癌25例，腺癌27例。高分化癌14例，中分化癌18例，低分化癌20例。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。另取癌旁正常肺組織19例。全部標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成

5、4μm厚連續(xù)切片。1.2試劑和方法鼠抗人DPC4、VEGF和CD34單克隆抗體購自MaximBio公司，均為即用型。免疫組化SPKit為MaximBio公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行，用PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性片作陽性對照，用DAB顯色，蘇木精復(fù)染。1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷DPC4和VEGF陽性顆粒主要分布于正常支氣管上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的胞漿（見圖1、2），以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。顯微鏡下觀察DPC4和VEGF蛋白的分布、陽性強(qiáng)度和陽性率。先按染色強(qiáng)度打分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強(qiáng)度需與

6、背景著色相對比；再按陽性細(xì)胞所占百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≥2分為免疫反應(yīng)陽性（+）。MVD計(jì)數(shù):按照VD(±s)，微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)是以腫瘤區(qū)內(nèi)染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，若有管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小及帶有較厚肌層的血管或壞死區(qū)域的血管均不予計(jì)數(shù)。1.4細(xì)胞凋亡檢測采用改良的TdT介導(dǎo)的dUTPbiotin切口末端標(biāo)記原位檢測法。標(biāo)記液及抗體購自德國BoehringerMannhein公司。凋亡陽性染色位于細(xì)胞核,呈棕黃色。

7、主要表現(xiàn)為核濃縮或核質(zhì)呈均勻的染色,染色質(zhì)邊聚,無白細(xì)胞浸潤（見圖3）。隨意挑選10個(gè)高倍鏡視野下陽性細(xì)胞與總細(xì)胞比值為AI。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS（11.5版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，DPC4的表達(dá)與不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2和Fisher’s精確檢驗(yàn)，DPC4和VEGF的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，DPC4與MVD和AI的關(guān)系采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1NSCLC中DPC4的表達(dá)DPC4在癌旁正常肺組織和肺癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)率分別為89.5%(17/19)、63.5%(33/52)(P＜0.05）。由表1可知，在肺腺癌中DPC4的陽性率明顯高于肺鱗癌

8、，但P>0.05；隨著分化程度的