受體介導(dǎo)的cmyc反義核酸抑制肝癌bel74

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1、受體介導(dǎo)的cmyc反義核酸抑制肝癌Bel74【摘要】　　目的探討半乳糖受體介導(dǎo)的cmyc反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN)抑制肝癌Bel7402細(xì)胞增殖的機制。方法cmycASODN與半乳糖(galactose,Gal)聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)相作用形成GalPEIASODN復(fù)合物，作用于人肝癌Bel7402細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、AnnexinVFITC和碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）雙染色、DNA電泳實驗觀察GalPEIASO

2、DN對Bel7402細(xì)胞的作用。結(jié)果采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞對照組、GalPEI對照組、ASODN對照組，細(xì)胞增殖指數(shù)分別為35.04%、33.95%、32.90%，GalPEIASODN組細(xì)胞增殖指數(shù)為23.65%，與細(xì)胞對照組相比，subG1期＋G0/G1期細(xì)胞總數(shù)從64.03%增加到76.74%，S期＋G2/M期的細(xì)胞從35.04%減少為23.65%，GalPEIASODN組細(xì)胞增殖指數(shù)下降11.39%，差異顯著（P<0.01）。采用細(xì)胞凋亡檢測試劑AnnexinVFITC/PI雙染檢測細(xì)胞壞死情況，細(xì)胞對照組細(xì)胞凋亡率2.77

3、%，壞死率3.06%，正常細(xì)胞率94.13%；ASODN對照組、GalPEI對照組細(xì)胞凋亡率均在4%以下，壞死率均在6.8%以下；GalPEIASODN組細(xì)胞凋亡率6.5%，壞死率15.9%，正常細(xì)胞率下降為76%。DNA電泳實驗中，GalPEIASODN組未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的DNA梯形條帶，相反出現(xiàn)了彌散條帶。結(jié)論半乳糖受體介導(dǎo)的cmyc反義核酸通過阻止細(xì)胞從G0/G1期細(xì)胞向S期的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，達到抑制細(xì)胞Bel7402增殖的作用?！娟P(guān)鍵詞】cmyc　反義核酸　肝癌　細(xì)胞壞死　細(xì)胞周期　　MechanismofcmycAntisenseOl

4、igodeoxynucleotideMediatedbyReceptorontheProliferativeInhibitionofBel7402CellsKeyyc;Antisenseoligodeoxynucleotide;Hepatocellularcarcinoma;Necrosis;Apoptosis　　cmyc基因是人們發(fā)現(xiàn)較早的一種原癌基因，cmyc蛋白是一種具有DNA結(jié)合功能的轉(zhuǎn)錄因子，啟動細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化，參與細(xì)胞凋亡。人類許多腫瘤可檢測到cmyc基因的異常表達，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、頭頸部腫瘤、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌

5、等。在正常肝組織，cmyc基因低表達或不表達，在原發(fā)性肝癌的癌組織及癌周組織中，cmyc蛋白表達水平顯著性升高；cmyc蛋白表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而且與肝癌的分期、預(yù)后有關(guān)[1,2]。cmyc反義核酸能抑制人肝癌細(xì)胞生長[3]。單純反義寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)導(dǎo)入細(xì)胞的效率不高，而受體介導(dǎo)的反義核酸投遞系統(tǒng)則具有高效、靶向的特點[4]。肝細(xì)胞表面具有脫唾液酸糖蛋白受體等5種專一性受體，能識別末端帶有半乳糖殘基的糖蛋白或人工合成的配體并與之結(jié)合，這種配體－受體的結(jié)合是非常高效的。前期實驗采用

6、半乳糖(Galactose,Gal)聚乙烯亞胺（polyethyleneimine,PEI）交聯(lián)載體與cmycASODN形成GalPEIASODN復(fù)合物，構(gòu)成以肝細(xì)胞膜半乳糖受體為靶向的反義核酸投遞系統(tǒng)，作用于人肝癌Bel7402細(xì)胞，證明半乳糖受體介導(dǎo)的cmyc反義核酸對人肝癌Bel7402細(xì)胞具有靶向投遞作用并能高效抑制該細(xì)胞的增殖[5]，本實驗旨在探討cmyc反義核酸抑制Bel7402細(xì)胞增殖的作用機制。1材料與方法1.1主要試劑及儀器半乳糖－聚乙烯亞胺(GalPEI)轉(zhuǎn)染試劑（法國PolyplusTransfection公司）。cmy

7、c反義核酸的合成：針對cmyc基因核苷酸序列162～179設(shè)計反義寡脫氧核苷酸并進行全程硫代修飾，上海生物工程公司合成，設(shè)計序列如下：5′CTTCTCGAGGCAGGAGGG3′，AnnexinVFITC/碘化丙錠（PropidiumIodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BenderMedsystems公司和北京寶塞生物技術(shù)公司）。CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，流式細(xì)胞儀(美國BectonDickinson公司)，Quantimet970凝膠圖像分析儀（英國劍橋儀器公司）。1.2細(xì)胞培養(yǎng)Bel7402肝癌細(xì)胞由中山大學(xué)北校區(qū)生化教研室惠贈

8、。細(xì)胞培養(yǎng)