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1、瀘州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文反義c-myc對(duì)MCF-7細(xì)胞hTERT基因表達(dá)抑制作用的研究姓名：馬莉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)（遺傳）指導(dǎo)教師：稅青林20040501反義c-myc對(duì)MCF-7細(xì)胞hTERT基因表達(dá)抑制作用的研究摘要目的：研究脂質(zhì)體LipfectAMINETM（LR）介導(dǎo)的c-myc反義寡核苷酸（ASODN）對(duì)MCF-7細(xì)胞端粒酶催化亞單位hTERT基因表達(dá)的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步闡明c-myc對(duì)hTERT基因的調(diào)控作用，并為針對(duì)端粒酶活性抑制的乳腺癌的基因治療提供理論依據(jù)。方法：培
2、養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，根據(jù)所購(gòu)脂質(zhì)體的廠家推薦劑量，按照每孔脂質(zhì)體200μl，寡核苷酸500μl的劑量配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入各孔細(xì)胞中。研究設(shè)置對(duì)照組、LR-SODN組及LR-ASODN組，每組6個(gè)復(fù)孔。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，分別收集各組細(xì)胞，用UNIQ柱式TRIZOL提取法提取各組總RNA，按MMLV一步法PCR（略作改進(jìn)）進(jìn)行hTERTmRNA表達(dá)的檢測(cè)，紫外凝膠成像分析儀進(jìn)行凝膠電泳產(chǎn)物的灰度掃描，以hTERT與內(nèi)對(duì)照引物β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）
3、的比值表示hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，α=0.05。結(jié)果：1.1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠電泳分析RNA提取樣品顯示28S和18S兩條清晰帶，前者的質(zhì)量是后者的2倍，表明RNA提取成功，提取樣品可用作RT-PCR的擴(kuò)增模板。2.RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析顯示：各組在PUCMixMarker145bp處均可見(jiàn)明暗不一的hTERT擴(kuò)增條帶，于540bp處可見(jiàn)明暗一致的β-actin擴(kuò)增帶；3.凝膠灰度掃描以hTERT和內(nèi)參照引物β-actin的灰度比值表示hTERT
4、mRNA相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組的5組hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.705、0.713、0.753、0.724和0.733；LR-SODN組24小時(shí)的5組hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.704、0.714、0.750、0.724和0.731；48小時(shí)的5組hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.703、0.713、0.747、0.726和0.730；72小時(shí)的5組hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.699、0.716、0.742、0.719和0.730；LR-ASODN組24小時(shí)的5組hTERTm
5、RNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.589、0.612、0.538、0.614和0.701；48小時(shí)的5組hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.289、0.218、0.274、0.265和0.254；72小時(shí)的5組hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.148、0.136、0.131、0.159和0.143。單因素方差分析顯示，LR-ASODN作用于MCF-7細(xì)胞24、48、72小時(shí)時(shí)hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別與LR-SODN、對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01），LR-SODN作用于MCF-7細(xì)胞24、48
6、、72小時(shí)時(shí)hTERTmRNA相對(duì)表達(dá)量分別與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）。并且ASODN對(duì)MCF-7細(xì)胞hTERT基因的抑制效果隨時(shí)間推移而逐漸升高。結(jié)論：1.LR介導(dǎo)的c-mycASODN能有效抑制MCF-7細(xì)胞中端粒酶hTERTmRNA表達(dá)水平，且抑制效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸明顯。本研究通過(guò)抑制hTERT的促進(jìn)因素—c-myc來(lái)改變hTERT活性，從逆向的角度進(jìn)一步證明c-myc對(duì)hTERT基因表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用；2.結(jié)合繼往c-mycASODN能有效抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)及其c-myc
7、蛋白表達(dá)的研究結(jié)果，推測(cè)其機(jī)制為：LR介導(dǎo)c-mycASODN通過(guò)封閉c-myc基因抑制其蛋白表達(dá)，下調(diào)hTERT基因表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)端粒酶活性，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。3.通過(guò)c-myc反義寡核苷酸封閉c-myc基因表達(dá)，下調(diào)hTERT基因表達(dá)水平，降低端粒酶活性，是一條可行性的腫瘤治療策略。關(guān)鍵詞c-myc基因；反義寡核苷酸；hTERT；逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）Studyontheinhibitiveeffectofliposome-mediatedc-mycantisenseoligonucleot
8、ideontelomeraseactivityandhTERTgeneexpressionofMCF-7cellsAbstract：Objective:Thepurposeofthisstudywastoinvestigatetheinhibitiveeffectofliposome(LipfectAMINETM,LR)-mediatedc-mycantisenseoligonucleotide(ASODN)onhumante
