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1、SiRNA穩(wěn)定抑制肝癌細(xì)胞hTERT基因的表達(dá)【關(guān)鍵詞】肝腫瘤StableinhibitionofhTERTgenebysiRNAinhepatocarcinomacells 【Abstract】AIM:ToelucidatethetimeefficiencyrelationofstableinhibitionofhepatocarcinomacellproliferationbyRNAinterferenceinvitro.METHODS:ThestablescreeninginhibitiontechniqueofRNAiallhairpinRNA
2、(shRNA)targetinghTERTgeneaSMMC7721cells,acelllinesstablelyexpressingpGenesilshRNAhTERT.RealtimeRTPCR,MTTandPCRTRAPRNAexpressions,telomeraseactivityandcellproliferation.RESULTS:TheeffectivenessofRNAiexistedcontinuallyandstablyinhepatocarcinomaSMMC7721cellsexpressingstablypGenesils
3、hRNAhTERT.InthecelllinesexpressingstablypGenesilshRNAhTERT,hTERTmRNAeraseactivitiesaSMMC7721cellproliferationsignificantlyinhibitedinpGenesilshRNAhTERTgroupparedtothatinnegativecontrolgroup.CONCLUSION:RNAimaycontinuallyandstablysuppresshTERTmRNAexpressionandcarcinomacellprolifera
4、tion,orgenetherapy. 【Keys;telomerase 【摘要】目的：利用RNA干擾穩(wěn)定篩選抑制技術(shù)，抑制人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因表達(dá)，探討靶向hTERT基因RNAi與抑制肝癌細(xì)胞增殖的時(shí)效關(guān)系.方法：設(shè)計(jì)靶向hTERT基因的小干擾RNA，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGenesilshRNAhTERT并導(dǎo)入肝癌SMMC7721細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)siRNAhTERT的細(xì)胞株.采用realtimeRTPCR、MTT和PCRTRAP法同時(shí)檢測(cè)pGenesilshRNAhTERT穩(wěn)定抑制組和未處理SMMC7721細(xì)胞組hT
5、ERT基因表達(dá)、端粒酶活性及細(xì)胞增殖變化.結(jié)果：在穩(wěn)定表達(dá)pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721細(xì)胞株中，RNAi效力持續(xù)、穩(wěn)定存在，hTERTmRNA表達(dá)、端粒酶活性明顯降低，瘤細(xì)胞增殖被抑制.結(jié)論：RNA干擾能持續(xù)、穩(wěn)定地抑制靶基因hTERTmRNA表達(dá)及腫瘤細(xì)胞增殖，是有潛力的基因治療腫瘤新方法. 【關(guān)鍵詞】RNA干擾；肝腫瘤；端粒，末端轉(zhuǎn)移酶 0引言 端粒酶的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)〔1〕，hTERT基因在肝癌中的表達(dá)陽(yáng)性率為89.5%〔2〕.研究表明hTERT的高表達(dá)能通過(guò)多分化刺激來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)
6、胞永生化〔3〕.我們依據(jù)RNA干擾（RNAinterference,RNAi）原理，使用短發(fā)夾樣RNA（smallhairpinRNA,shRNA）設(shè)計(jì)的RNAiDNA載體方法〔4〕，以hTERT基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的肝癌SMMC7721細(xì)胞株，從體外研究siRNA穩(wěn)定、特異誘導(dǎo)hTERT基因轉(zhuǎn)錄后沉默，逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞惡性表型的能力，探討RNAi基因治療惡性腫瘤的時(shí)效性. 1材料和方法 1.1材料 肝癌SMMC7721細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所.質(zhì)粒pGenesil1購(gòu)自武漢晶賽生
7、物工程技術(shù)有限公司.限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ購(gòu)自Roche公司,總RNA提取試劑、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000等分別購(gòu)自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHybKit購(gòu)自華美生物工程公司.Taqman探針和引物由Takara公司合成，hTERT及內(nèi)參PO的探針和引物序列參照文獻(xiàn)〔4〕.siRNAhTERT轉(zhuǎn)錄模板由上海博亞公司合成. 1.2方法 shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列長(zhǎng)度為69bp，兩端分別為BamHⅠ,HindⅢ酶切位點(diǎn)，中間為9bp莖環(huán)序列分隔的反向重復(fù)靶序列，并以6個(gè)T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止
8、子.質(zhì)粒構(gòu)建采用BamHⅠ,HindⅢ雙酶切空質(zhì)粒pGenesil1，將shRN
