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《sirna表達載體對mcf-7細胞生長及其htert蛋白表達抑制的研究論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、英文縮寫PTGS英漢縮略名詞對照表英文全稱中文譯名post-transcriptionalgenesilencing轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默現(xiàn)象SDS-PAGESDSpolyacrylamidegel，electrophoresis聚丙烯酰氨凝膠電泳4ⅣD溺bpDMSOEGFPhTERTh豫TPlKanarmRNARNARN觸shRNAsiRNAdsRNArpmanalysisofvariancebasepair方差分析堿基對Dimethylsulphoxide二甲基亞砜enhancementgreenfluorescentprotein增強型綠色熒光蛋白humantelomeras
2、ereversetranscriptase人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶humantelomeraseRNAtelomeraseprotein1KanamycinmessageribonucleicacidribonucleicacidRNAinterferencesmallhairpinRNAsmallinterferenceRNAdouble-strandedRNA，dsRNAratesperminute．39．人端粒酶RNA端粒酶相關(guān)蛋白1卡那霉素信使核糖核酸核糖核酸RNA干擾短發(fā)夾RNA／I、千擾RNA'●W?’一一雙鏈RNA每分鐘轉(zhuǎn)速瀘州醫(yī)學院碩士研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所
3、呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。學位論文中除了特別加以標注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻均已在學位論文中作了明確的說明并表示了謝意。學位論文作者簽名：辯醐：7"州日瀘州醫(yī)學院學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解瀘州醫(yī)學院有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：瀘州醫(yī)學院有權(quán)保留并向有關(guān)部門或機構(gòu)送交學位論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)瀘州醫(yī)學院可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以公布學位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復制手段保存
4、學位論文，即：瀘州醫(yī)學院具有學位論文的數(shù)字化制品復制權(quán)，信息網(wǎng)絡傳播權(quán)和匯編權(quán)。保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書。El一=易日簽字日期勿b7午廠月方紗日siRNA表達載體對MCF．7細胞生長及其hTERT蛋白表達抑制的研究摘要目的：構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的RNA干擾(RNAi)表達載體，探討該表達載體對人乳腺癌細胞系MCF．7細胞生長及其hTERT蛋白表達的特異性抑制作用。方法：設(shè)計針對hTERT基因的干擾靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA，合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸，其排列順序為BamHI酶切位點、19nt正義序列、9ntloop序列
5、、19nt反義序列、RNA聚合酶ⅡI終止子(6個T)、SalI酶切位點、HindIII酶切位點。合成后退火形成雙鏈DNA。將pGenesil．1表達載體BamHI、HindlII雙酶切后電泳分離，純化回收4800bp左右的大片段。退火形成的雙鏈DNA通過T4DNA連接酶連接到線性化pGenesil．1質(zhì)粒U6啟動子下游，構(gòu)建重組siRNA表達質(zhì)粒pGenesil．hTERT。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞DH5a，經(jīng)Kana‘抗性篩選，挑選陽性克隆菌落搖菌擴增，并抽提純化質(zhì)粒，將抽提的重組質(zhì)粒分別做PstI和SalI單酶切和瓊脂糖電泳分析，同時做測序鑒定以確定插
6、入的干擾片段準確無誤，即針對hTERT基因的siRNA表達載體構(gòu)建成功。同時完成不針對任何基因的陰性對照重組質(zhì)粒的構(gòu)建。培養(yǎng)MCF．7細胞，待細胞生長狀態(tài)良好并達到指數(shù)生長期時，于轉(zhuǎn)染前一日接種于4個96孔板，每板設(shè)置空白組、脂質(zhì)體組、陰性對照組及pGenesil．hTERT組。以每孔O．15“g重組質(zhì)粒、0．375山LipofectamineTM2000脂質(zhì)體配成轉(zhuǎn)染復合物，加入各孔MCF．7細胞中進行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體組用無菌水代替質(zhì)粒，空白組不加任何試劑)，分別于轉(zhuǎn)染后24h、36h、48h、72h用MTT法檢測細胞增殖情況；之后將指數(shù)生長期細胞接種于6孔板，組別設(shè)置同前，以每
7、孔3弘g重組質(zhì)粒、7．5出脂質(zhì)體配成轉(zhuǎn)染復合物，加入各孔MCF．7細胞中進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h重組質(zhì)粒上帶有的EGFP基因得以表達，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞所占比例，。以此來判斷轉(zhuǎn)染效率。接著裂解各組細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以各組總蛋白為模板，B．肌動蛋白(B．a(chǎn)ctin)為內(nèi)對照進行SDS．PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗雜交孵育，最后化學發(fā)光液顯影并用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)自動曝光。結(jié)果用凝膠成像儀掃描QuantityOne4．4．0軟件分析，檢測各組hTERT蛋白的
