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《sirna穩(wěn)定抑制肝癌細胞htert基因的表達論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、SiRNA穩(wěn)定抑制肝癌細胞hTERT基因的表達論文【關(guān)鍵詞】肝腫瘤StableinhibitionofhTERTgenebysiRNAinhepatocarcinomacells【Abstract】AIM:ToelucidatethetimeefficiencyrelationofstableinhibitionofhepatocarcinomacellproliferationbyRNAinterferenceinvitro.METHODS:ThestablescreeninginhibitiontechniqueofRNAiallh
2、airpinRNA(shRNA)targetinghTERTgeneaSMMC7721cells,acelllinesstablelyexpressingpGenesilshRNAhTERT.RealtimeRTPCR,MTTandPCRTRAPRNAexpressions,telomeraseactivityandcellproliferation.RESULTS:TheeffectivenessofRNAiexistedcontinuallyandstablyinhepatocarcinomaSMMC7721cellsexpress
3、ingstablypGenesilshRNAhTERT.InthecelllinesexpressingstablypGenesilshRNAhTERT,hTERTmRNAeraseactivitiesaSMMC7721cellproliferationsignificantlyinhibitedinpGenesilshRNAhTERTgroupparedtothatinnegativecontrolgroup.CONCLUSION:RNAimaycontinuallyandstablysuppresshTERTmRNAexpressi
4、onandcarcinomacellproliferation,orgenetherapy.【Keys;telomerase【摘要】目的：利用RNA干擾穩(wěn)定篩選抑制技術(shù)，抑制人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因表達，探討靶向hTERT基因RNAi與抑制肝癌細胞增殖的時效關(guān)系.方法：設(shè)計靶向hTERT基因的小干擾RNA，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGenesilshRNAhTERT并導入肝癌SMMC7721細胞株，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定表達siRNAhTERT的細胞株.采用realtimeRTPCR、MTT和PCRTRAP法同時檢測pGenesil
5、shRNAhTERT穩(wěn)定抑制組和未處理SMMC7721細胞組hTERT基因表達、端粒酶活性及細胞增殖變化.結(jié)果：在穩(wěn)定表達pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721細胞株中，RNAi效力持續(xù)、穩(wěn)定存在，hTERTmRNA表達、端粒酶活性明顯降低.freelRNA表達及腫瘤細胞增殖，是有潛力的基因治療腫瘤新方法.【關(guān)鍵詞】RNA干擾；肝腫瘤；端粒，末端轉(zhuǎn)移酶0引言端粒酶的異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后密切相關(guān)［1］，hTERT基因在肝癌中的表達陽性率為89.5%［2］.研究表明hTERT的高表達能通過多分化刺激來抑制細胞凋
6、亡，導致細胞永生化［3］.我們依據(jù)RNA干擾（RNAinterference,RNAi）原理，使用短發(fā)夾樣RNA（smallhairpinRNA,shRNA）設(shè)計的RNAiDNA載體方法［4］，以hTERT基因為靶點，構(gòu)建穩(wěn)定表達小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的肝癌SMMC7721細胞株，從體外研究siRNA穩(wěn)定、特異誘導hTERT基因轉(zhuǎn)錄后沉默，逆轉(zhuǎn)癌細胞惡性表型的能力，探討RNAi基因治療惡性腫瘤的時效性.1材料和方法1.1材料肝癌SMMC7721細胞株購自上海細胞生物研究所.質(zhì)粒pGenesil
7、1購自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司.限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ購自Roche公司,總RNA提取試劑、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000等分別購自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHybKit購自華美生物工程公司.Taqman探針和引物由Takara公司合成，hTERT及內(nèi)參PO的探針和引物序列參照文獻［4］.siRNAhTERT轉(zhuǎn)錄模板由上海博亞公司合成.1.2方法shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列長度為69bp，兩端分別為BamHⅠ,HindⅢ酶切位點，中間為9bp莖環(huán)序列分隔的反向重復靶序列，并以6個T作
8、為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子.質(zhì)粒構(gòu)建采用BamHⅠ,.freelineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法.操作按說明書進行，質(zhì)?！弥|(zhì)體=1∶3.2RNA表達實時PCR反應(yīng)體系25μL，內(nèi)含5×realtimePC
