針對s基因的sirna抑制hepg2+2215細胞中hbv基因的表達

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1、428以科學發(fā)展觀促進科技創(chuàng)新(下)作者簡介王以光，中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物代謝工程研究室主任，教授，博士生導(dǎo)師。北京生物工程學會理事，中國生物工程學會會員[E44000435S(z)]，中國藥學會高級會員(000204)。電話：01063038137，傳真：01063176489；E—mail：wangyh456@yahoo．com．cn。針對S基因的siRNA抑制HepG22．2．15細胞中HBV基因的表達楊安鋼劉家云第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部免疫學教研室，西安，710032摘要構(gòu)建針對乙型肝炎病毒．(HBV)S基因的siRNA表達載體，觀察其對HBV基因表達的影響。結(jié)果顯示si

2、RNA能明顯抑制HepG22．2．15細胞HBsAg和HBeAg的分泌，并顯著降低HBVmRNA的表達。表明栽體產(chǎn)生的siRNA能穩(wěn)定、高效、特異地抑制HBV基因的表達。關(guān)鍵詞基因治療乙型肝炎病毒RNA干涉轉(zhuǎn)染由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)持續(xù)感染所引起的病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等已成為嚴重危害我國人民生命健康的疾病，迄今尚無有效的抗病毒治療手段。RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是雙鏈RNA(double—strandRNA，dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttran．scriptionalgenesilencing，PT

3、GS)現(xiàn)象，廣泛存在子多種生物體中，具有高效性和特異性。目前，RNAi已發(fā)展成為一種高效的實驗技術(shù)，廣泛用于新基因篩選、基因功能鑒定以及基因治療等方面，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。為探索RNAi對HBV的復(fù)制是否具有穩(wěn)定、高效、特異性抑制作用，我們選擇HBV表面抗原編碼區(qū)(S區(qū))基因為靶序列，構(gòu)建了含有能產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小干涉RNA(shortinterferingRNA，siRNA)的載體pSUPER—S1和pSUPER—S2，并分別與pTK—Hyg質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達HBV的HepG22．2．15細胞，經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定細胞克隆，對所得細胞上清中的HBsAg和HBeAg進行定量檢測，用RT

4、—PCR檢測其對靶基因tuRNA的抑制效果。一、材料與方法(一)質(zhì)粒、細胞和引物含H1啟動子的siRNA表達載體pSUPER和潮霉索抗性質(zhì)粒pTK～Hyg均為第四軍醫(yī)大學免疫學教研室保存。穩(wěn)定表達HBV的HepG22．2．15細胞系由第四軍醫(yī)大學病原生物學教研室提供，在含10％胎牛血清(Invitrogen公司)和200t-tg／mLG418的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO：培養(yǎng)。用于擴增HBVS區(qū)序列的上游引物caacttgtcctggttatcgc，下游序列aagccctacgaaccactgaa；用于擴增內(nèi)參照3一磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydephosphated

5、ehydrogenase，GAPDH)基因的上游引物序列caacggattt．ggtcgtattggg，下游引物序列cctggaagatggtgatgggatt，上述引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成。(二)主要試劑T4DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶(PNK)和各種限制性內(nèi)切酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品，胎牛第21分會場生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化429=======#===============‘===================z=====2====2z一血清、DMEM培養(yǎng)基和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司，G418為Sigma產(chǎn)品，潮霉素購

6、于Roche公司。鼠抗HBs、兔抗HBc和SABC—Cy3免疫熒光檢測試劑盒購于武漢博士德公司。(三)HBVS基因siRNA表達載體的構(gòu)建根據(jù)siRNA的設(shè)計原則，從HBVS基因編碼區(qū)中尋找符合設(shè)計特征的靶序列，經(jīng)BLAST軟件進行同源分析證實為HBV保守序列后，選擇HBV編碼區(qū)413—431、671—689核菅酸序列為S基因干涉位點。HBV—S1序列tcctgctgctatgcctcat，HBV—S2序列g(shù)gctcagtttactagtgcc；此外還設(shè)計了增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的siRNA表達載體pSUPER—EGFP為對照，其序列g(shù)gacgacggcaactacaag。合成的編

7、碼siRNA的單鏈寡核苷酸經(jīng)退火、磷酸化，克隆入pSUPER載體，EcoRI和HindⅢ酶切鑒定，陽性克隆切出大約300bp的條帶，而空質(zhì)粒的大小為240bp，篩選出含HBV基因的陽性克隆，并進行DNA測序加以確定。(四)細胞轉(zhuǎn)染及單克隆細胞株的篩選HepG22．2．15細胞生長于含10％胎牛血清、200t-g／mlG418的DMEM培養(yǎng)基中，接種于6孔板，24h后分別以pSUPER—S1、pSUPER—S2、pSUPE