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《sirna表達載體對mcf-7細胞生長及其htert蛋白表達抑制的研究論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、英文縮寫PTGS英漢縮略名詞對照表英文全稱中文譯名post-transcriptionalgenesilencing轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默現(xiàn)象SDS-PAGESDSpolyacrylamidegel，electrophoresis聚丙烯酰氨凝膠電泳4ⅣD溺bpDMSOEGFPhTERTh豫TPlKanarmRNARNARN觸shRNAsiRNAdsRNArpmanalysisofvariancebasepair方差分析堿基對Dimethylsulphoxide二甲基亞砜enhancementgreenfluorescentprotein增強型綠色熒光蛋白humantelomeras
2、ereversetranscriptase人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶humantelomeraseRNAtelomeraseprotein1KanamycinmessageribonucleicacidribonucleicacidRNAinterferencesmallhairpinRNAsmallinterferenceRNAdouble-strandedRNA，dsRNAratesperminute．39．人端粒酶RNA端粒酶相關(guān)蛋白1卡那霉素信使核糖核酸核糖核酸RNA干擾短發(fā)夾RNA／I、千擾RNA'●W?’一一雙鏈RNA每分鐘轉(zhuǎn)速瀘州醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所
3、呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。學(xué)位論文中除了特別加以標注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻均已在學(xué)位論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：辯醐：7"州日瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解瀘州醫(yī)學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：瀘州醫(yī)學(xué)院有權(quán)保留并向有關(guān)部門或機構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)瀘州醫(yī)學(xué)院可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存
4、學(xué)位論文，即：瀘州醫(yī)學(xué)院具有學(xué)位論文的數(shù)字化制品復(fù)制權(quán)，信息網(wǎng)絡(luò)傳播權(quán)和匯編權(quán)。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書。El一=易日簽字日期勿b7午廠月方紗日siRNA表達載體對MCF．7細胞生長及其hTERT蛋白表達抑制的研究摘要目的：構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的RNA干擾(RNAi)表達載體，探討該表達載體對人乳腺癌細胞系MCF．7細胞生長及其hTERT蛋白表達的特異性抑制作用。方法：設(shè)計針對hTERT基因的干擾靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA，合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸，其排列順序為BamHI酶切位點、19nt正義序列、9ntloop序列
5、、19nt反義序列、RNA聚合酶ⅡI終止子(6個T)、SalI酶切位點、HindIII酶切位點。合成后退火形成雙鏈DNA。將pGenesil．1表達載體BamHI、HindlII雙酶切后電泳分離，純化回收4800bp左右的大片段。退火形成的雙鏈DNA通過T4DNA連接酶連接到線性化pGenesil．1質(zhì)粒U6啟動子下游，構(gòu)建重組siRNA表達質(zhì)粒pGenesil．hTERT。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞DH5a，經(jīng)Kana‘抗性篩選，挑選陽性克隆菌落搖菌擴增，并抽提純化質(zhì)粒，將抽提的重組質(zhì)粒分別做PstI和SalI單酶切和瓊脂糖電泳分析，同時做測序鑒定以確定插
6、入的干擾片段準確無誤，即針對hTERT基因的siRNA表達載體構(gòu)建成功。同時完成不針對任何基因的陰性對照重組質(zhì)粒的構(gòu)建。培養(yǎng)MCF．7細胞，待細胞生長狀態(tài)良好并達到指數(shù)生長期時，于轉(zhuǎn)染前一日接種于4個96孔板，每板設(shè)置空白組、脂質(zhì)體組、陰性對照組及pGenesil．hTERT組。以每孔O．15“g重組質(zhì)粒、0．375山LipofectamineTM2000脂質(zhì)體配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入各孔MCF．7細胞中進行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體組用無菌水代替質(zhì)粒，空白組不加任何試劑)，分別于轉(zhuǎn)染后24h、36h、48h、72h用MTT法檢測細胞增殖情況；之后將指數(shù)生長期細胞接種于6孔板，組別設(shè)置同前，以每
7、孔3弘g重組質(zhì)粒、7．5出脂質(zhì)體配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入各孔MCF．7細胞中進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h重組質(zhì)粒上帶有的EGFP基因得以表達，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞所占比例，。以此來判斷轉(zhuǎn)染效率。接著裂解各組細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以各組總蛋白為模板，B．肌動蛋白(B．a(chǎn)ctin)為內(nèi)對照進行SDS．PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗雜交孵育，最后化學(xué)發(fā)光液顯影并用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)自動曝光。結(jié)果用凝膠成像儀掃描QuantityOne4．4．0軟件分析，檢測各組hTERT蛋白的
