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《端粒酶htert基因反義rna表達載體構建及其對肝癌細胞smmc-7721作用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、摘要端粒是真核細胞線性染色體末端特殊的DNA-蛋白質結構具有維持染色體的結構穩(wěn)定和生物功能的作用.隨著細胞分裂端粒每次縮短30200bp當端粒縮短到某臨界長度時細胞則發(fā)生衰老或凋亡而許多腫瘤細胞由于某種機制的作用激活了端粒酶從而使端粒維持在一定長度使癌細胞能夠持續(xù)繁殖端粒酶是一種核糖蛋白酶端粒酶催化亞基具有逆轉錄酶活性能以自身RNA為模板向染色體末端添加端粒序列彌補端粒的丟失阻止端?？s短據(jù)統(tǒng)計大部分惡化腫瘤中端粒酶檢測為陽性,由于端粒酶活性和腫瘤細胞的生存與轉化間存在如此高的相關性人們認為兩者之間必然有某種聯(lián)系端粒酶激活可能是細胞癌變或永生化的一個必然通路因此抑制端粒酶活性可作
2、為腫瘤基因治療的一個理想的新靶點本文以分子克隆技術成功構建人端粒逆轉錄酶(hTERT)基因反義RNA表達載體研究其對肝癌細胞SMMC-7721生長的影響采用聚合酶鏈反應PCR擴增hTERT基因片段經測序證實后反向插入到表達載體pcDNA3.1/myc-His中成功構建hTERT基因反義表達載體pcDNA3.1-hTERT(as)經脂質體介導轉染人肝癌細胞株SMMC-7721,通過新霉素類似物(G418)篩選獲得表達端粒酶hTERT基因反義RNA的穩(wěn)定細胞株采用噻唑藍MTT法端粒重復序列擴增-酶連免疫吸附檢測法TRAP-ELISA流式細胞術和熒光定量PCR儀分別觀察細胞的增殖端粒
3、酶的活性和細胞凋亡及細胞hTERT基因mRNA的水平結果發(fā)現(xiàn)1.通過細胞生長曲線的繪制和MTT法研究端粒酶hTERT基因反義RNA對肝癌細胞SMMC-7721生長的影響結果表明與對照組細胞相比hTERT基因反義RNA能明顯抑制肝癌細胞生長2.通過TRAP-ELISA法研究端粒酶hTERT基因反義RNA對肝癌細胞端粒酶活性的影響hTERT反義RNA轉入肝癌細胞SMMC-7721后與對照組相比細胞端粒酶活性明顯降低3.通過流式細胞儀研究端粒酶hTERT基因反義RNA對肝癌細胞的凋亡和細I胞周期的影響轉染hTERT反義RNA的SMMC-7721肝癌細胞在培養(yǎng)一段時間后出現(xiàn)DNA亞二倍
4、體凋亡峰凋亡率為13.77%,明顯高于SMMC-7721肝癌細胞的3.29%和轉染空載體pcDNA3.1的SMMC-7721肝癌細胞的3.37%凋亡率顯著提高與對照組相比轉染hTERT反義RNA的SMMC-7721肝癌細胞的細胞周期發(fā)生明顯變化其S期細胞數(shù)量明顯增加G0/G1期細胞數(shù)量明顯減少4.通過熒光定量PCR儀研究端粒酶hTERT基因反義RNA對肝癌細胞的hTERTmRNA水平的影響與對照組相比轉染細胞的hTERTmRNA的水平無變化本研究表明hTERT基因反義RNA可有效抑制肝癌細胞生長和誘導細胞凋亡為反義RNA治療肝癌提供了實驗基礎為肝癌的基因治療提供了一種新的方法關
5、鍵詞端粒端粒酶反義RNA肝癌細胞IIAbstractTelomeresarespecializedribonucleoproteinstructuresattheendsofeukaryoticlinearchromosomes.Theyarecomposedofrepetitivenucleotidesequencesandassociatedproteinsthatprotectchromosomesfromdegradationandrecombination.Theyareessentialforchromosomestability.Inhumansomaticcel
6、ls,telomeresshortenby30to200bpwitheachcelldivision.Whentelomereswereshortenedtosomethresholdvalue,cellsenescenceorapoptosiswastriggered.Themechanismisthattelomeraseisactivatedsothattelomeresaremaintainedatacertainlengthintumors,keepingcellgrowing.Telomeraseisaribonucleoproteincomplexthatadds
7、TTAGGGrepeatsontothe3'endsofchromosomalDNAtermini,therebycompensatingforincompletereplication.Humantelomerasereversetranscripase(hTERT)isakeycomponentoftelomerasecatalyticactivity.Hightelomeraseactivityhasbeendemonstratedin85to90ofallhumantumorsacc
