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《啟動(dòng)子克隆及活性分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、第6章CpLTP3、CpITP/j基因啟動(dòng)子克隆及瞬時(shí)表達(dá)分析為了深入探索蠟梅nsLTPs基因家族4個(gè)成員CpLTPl、CpLTP2、CpLTP3、C/兒7P4在表達(dá)和功能上存在差異的原因，需要進(jìn)一步克隆各個(gè)成員的啟動(dòng)子，以便尋找調(diào)控方面的差異。我們利用hiTAIL-PCR法分離得到了CpLTP3、CpLTP4基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并對(duì)調(diào)控原件和瞬時(shí)表達(dá)活性進(jìn)行了分析，另外兩個(gè)基因啟動(dòng)子暫時(shí)沒有得到成功分離，所以沒有進(jìn)行分析。6.1實(shí)驗(yàn)材料6.1.1植物材料供試蠟梅開花大樹品種為罄口蠟梅，種植于西南大學(xué)校園內(nèi)，常規(guī)管理。蠟梅小苗
2、通過種子繁殖培育，種子采自西南大學(xué)校園罄口蠟梅樹。培養(yǎng)條件為濕度85%,16h光照（2000Lx）,溫度25°C,8h黑暗,溫度20°C。煙草W38（Nicotianatobacumcv.Wisconsin38）由本實(shí)騎室保存擴(kuò)繁。大腸打?菌QEsherichiacoli）菌株TOP10，為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。根癌農(nóng)打菌CAgrobacteriumtumefacieus）LBA4404，用于農(nóng)桿?菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化，由本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體PMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司。植物表達(dá)載體pBI121，具有Km抗性
3、和完整的Gt/S基因表達(dá)元件，用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體。6.1.3主要試劑TaqDNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、Mgcl2、dNTP、T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；DL2000、DNAMaker、質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒均購(gòu)自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA測(cè)序均由生物工程有限公司合成；氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均購(gòu)自上海生物工程有限公同。6.1.4主要設(shè)備紫外分光光度儀（島津），高速冷凍離心機(jī)（HITACHI）,臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendoff）,TGL
4、-16B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭），EppendorfPCR儀，IKA型渦旋器（德國(guó)產(chǎn)），高壓火菌鍋（日本產(chǎn)），超低溫冰箱（sanyo），DYYIII型電泳儀（北京六一廠），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），F(xiàn)R-1型凝膠成像系統(tǒng)（上海第6章CpLTP3、CpITP/j基因啟動(dòng)子克隆及瞬時(shí)表達(dá)分析為了深入探索蠟梅nsLTPs基因家族4個(gè)成員CpLTPl、CpLTP2、CpLTP3、C/兒7P4在表達(dá)和功能上存在差異的原因，需要進(jìn)一步克隆各個(gè)成員的啟動(dòng)子，以便尋找調(diào)控方面的差異。我們利用hiTAIL-PCR法分離得到了CpLTP3、
5、CpLTP4基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并對(duì)調(diào)控原件和瞬時(shí)表達(dá)活性進(jìn)行了分析，另外兩個(gè)基因啟動(dòng)子暫時(shí)沒有得到成功分離，所以沒有進(jìn)行分析。6.1實(shí)驗(yàn)材料6.1.1植物材料供試蠟梅開花大樹品種為罄口蠟梅，種植于西南大學(xué)校園內(nèi)，常規(guī)管理。蠟梅小苗通過種子繁殖培育，種子采自西南大學(xué)校園罄口蠟梅樹。培養(yǎng)條件為濕度85%,16h光照（2000Lx）,溫度25°C,8h黑暗,溫度20°C。煙草W38（Nicotianatobacumcv.Wisconsin38）由本實(shí)騎室保存擴(kuò)繁。大腸打?菌QEsherichiacoli）菌株TOP10，為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
6、受體菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。根癌農(nóng)打菌CAgrobacteriumtumefacieus）LBA4404，用于農(nóng)桿?菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化，由本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體PMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司。植物表達(dá)載體pBI121，具有Km抗性和完整的Gt/S基因表達(dá)元件，用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體。6.1.3主要試劑TaqDNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、Mgcl2、dNTP、T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；DL2000、DNAMaker、質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒均購(gòu)自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA測(cè)序均由生物工程有限公司合成
7、；氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均購(gòu)自上海生物工程有限公同。6.1.4主要設(shè)備紫外分光光度儀（島津），高速冷凍離心機(jī)（HITACHI）,臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendoff）,TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭），EppendorfPCR儀，IKA型渦旋器（德國(guó)產(chǎn)），高壓火菌鍋（日本產(chǎn)），超低溫冰箱（sanyo），DYYIII型電泳儀（北京六一廠），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），F(xiàn)R-1型凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日），722型分光光度計(jì)（重慶川儀九廠），恒溫振蕩搖床，恒溫培養(yǎng)箱，
8、水浴鍋。6.1.5常用溶液配方氨芐青霉素（Amp）:水溶，超濾，貯存濃度50mg/mL,-20°C避光保存?？敲顾兀↘m）:水溶，超濾，貯存濃度50mg/mL，-2（TC避光保存。TE（pH8.0）：10mmol/LTris-Cl（pH8.O）,lmmol/LEDTA（pH8.O）。50
