AHI基因啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性的鑒定課件.pptx

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1、研究背景Joubert綜合征常染色體遺傳病臨床表現(xiàn)：小腦共濟(jì)失調(diào)，雙眼運(yùn)動(dòng)不能，肌張力減弱；病因：發(fā)育過程中小腦齒狀核和皮質(zhì)脊髓束的神經(jīng)元軸突不能穿越中線形成神經(jīng)交叉。立論依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：小鼠同源基因Ahi1在小腦齒狀核和深部第五層皮層神經(jīng)元中高表達(dá)，齒狀核神經(jīng)元軸突穿越中線，參與形成小腦上腳；而深部皮層神經(jīng)元的軸突形成皮質(zhì)脊髓束．當(dāng)Ahi1基因發(fā)生突變，小腦齒狀核神經(jīng)元和深部皮層神經(jīng)元的軸突則不能穿越中線，表現(xiàn)出Joubert綜合征；研究表明：Joubert綜合征家系的患者有AHI1基因的移碼突變和

2、錯(cuò)義突變；結(jié)論：AHI1基因在皮質(zhì)脊髓束和小腦齒狀核神經(jīng)元穿越中線的過程中發(fā)揮著重要作用。AHI1基因基因結(jié)構(gòu)：6q23.2，含有28個(gè)外顯子表達(dá)部位：成年人小腦和大腦皮質(zhì)中高表達(dá)當(dāng)前進(jìn)展：至今AHI1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚.．研究內(nèi)容：本課題擬通過研究AHI1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以揭示Joubert綜合征的發(fā)生機(jī)理和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)元穿越中線的分子機(jī)制．研究方法利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息利用基因工程方法驗(yàn)證不同長度AHI15’端側(cè)翼序列是否具有啟動(dòng)調(diào)控活性在生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，以E

3、MSA法分析與之結(jié)合的因子將已克隆入pEGFP-1的AHI1轉(zhuǎn)錄活性序列及與之結(jié)合的調(diào)節(jié)因子ORF的重組子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過分析熒光蛋白活性分析反式作用因子對(duì)AHI1轉(zhuǎn)錄的影響技術(shù)路線㈠預(yù)測(cè)AHI1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息①在Genbank中找到AHI1的基因組序列(No.NT_025741)②利用Promoter2.0,Genescan等軟件分析AHI1基因序列，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的位置．③用CapsiteHunting法確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)．㈡重組克隆不同長度的5’端側(cè)翼序列①根據(jù)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子位置設(shè)計(jì)上游下游引物。

4、②通過PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子的不同長度5’端側(cè)翼序列。③以pEGFP-1質(zhì)粒為載體，重組克隆不同長度5’端側(cè)翼序列．㈢轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞cos-7，通過分析綠色熒光蛋白表達(dá)的有無和亮度確定具有轉(zhuǎn)錄活性的序列．5‘端側(cè)翼序列①陰性對(duì)照組：pEGFP-1②陽性對(duì)照組：pEGFP-N1③實(shí)驗(yàn)組：AHI1-pEGFP-1㈣通過生物信息學(xué)分析能與具有轉(zhuǎn)錄活性的序列相結(jié)合的調(diào)節(jié)因子，以EMSA法驗(yàn)證．EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,電泳遷移率實(shí)驗(yàn))㈤將分別含有調(diào)節(jié)因子ORF

5、和調(diào)控活性序列的重組子共轉(zhuǎn)染cos-7，通過分析綠色熒光蛋白表達(dá)的有無和亮度，分析調(diào)節(jié)因子對(duì)AHI1基因轉(zhuǎn)錄的影響．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：①對(duì)照組：含AHI1啟動(dòng)子序列的重組pEGFP-1轉(zhuǎn)染COS-7②實(shí)驗(yàn)組：AHI1啟動(dòng)子序列的重組pEGFP-1編碼調(diào)節(jié)因子ORF的重組子共轉(zhuǎn)染COS－7預(yù)期結(jié)果⒈確定AHI1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)⒉克隆出AHI15’端轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列⒊找到能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列相互作用的反式作用因子，并進(jìn)一步闡明AHI1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制謝謝！