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《人胰島因子1基因啟動(dòng)子的克隆及活性鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、人胰島因子1基因啟動(dòng)子的克隆及活性鑒定路康金蕊南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科摘要：目的:克隆含人胰島因子1(isletl，ISL1)基因上游啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒并檢測(cè)其在人胚腎HEK-293細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性。方法：以HEK-293細(xì)胞提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增1SL1基因啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)1419bp片段;酶切后將此片段連接至pGL3-Basic載體，克隆含有ISL1基因啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒：以此重組質(zhì)粒為模板重復(fù)上述步驟構(gòu)建一系列TSL1啟動(dòng)子5’側(cè)翼區(qū)截短質(zhì)粒。將含TSL1啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒及其截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)
2、染至人胚腎IIEK-293細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)各片段的啟動(dòng)子活性，找出啟動(dòng)子最小活性區(qū)域，并通過生物信息學(xué)方法分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果:經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建含有1SL1啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒及其截短質(zhì)粒。與pGL3-Basic空載體相比，含有ISL1啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒啟動(dòng)子活性明顯增加(P<0.01)。TSL1最小活性區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-173bp至-1bp之間,其中包含OCT-1、MYOD、E2F2等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論:人ISL1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1215bp區(qū)域在HEK-293細(xì)
3、胞中具有較強(qiáng)啟動(dòng)子活性。關(guān)鍵詞：?jiǎn)?dòng)子活性;胰島因子1;人胚腎細(xì)胞;作者簡(jiǎn)介：周國(guó)平:通訊作者,E-mail:guopzhou@126.com收稿日期：2017-06-17Received：2017-06-17先天性心臟病是新生兒最常見的先天性疾病，其主要病因是胎兒期心臟及大血管的發(fā)育出現(xiàn)了異常m。心臟作為胚胎發(fā)育中最為重要的器官，其分化發(fā)育是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，牽涉許多基因的先后表達(dá)以及相互作用。而各種不同心臟組織可能是由心臟多種祖細(xì)胞分化形成，胰島因子1(islctl,ISL1)作為心臟祖細(xì)胞的標(biāo)志分
4、子之一，其表達(dá)有著精確的時(shí)空調(diào)控機(jī)制，1SL1心臟祖細(xì)胞主要參與心臟第二生心區(qū)的分化發(fā)育，成熟心臟中的眾多細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和起搏細(xì)胞均可由其分化發(fā)育而來1^1?，F(xiàn)普遍認(rèn)為TSL1是位于心臟分化發(fā)育復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起始部分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)ISL1可與GATA4轉(zhuǎn)錄因子共同作用于下游靶基因來影響小鼠心臟分化發(fā)育U1，而ISL1基因突變純合子小鼠大約在胚胎發(fā)育的第10-11天間因嚴(yán)重的心臟發(fā)育缺陷而死亡包1，由此可見TSL1對(duì)于心臟的分化發(fā)育至關(guān)重要。許多基因的表達(dá)都是通過各種轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子序列
5、的結(jié)合進(jìn)行調(diào)控m，目前對(duì)于ISL1基因的啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)滎調(diào)控機(jī)制還不是很清楚，故本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建人1SL1基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒，進(jìn)一步探討ISL1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為了解先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制提供新視角。1材料與方法1.1材料PGL3-B棊本載體（pGL3-Basic）和11EK-293細(xì)胞均本實(shí)驗(yàn)室保存;棊因組DNA提取試劑盒、感受態(tài)大腸埃希菌（北京天根公司）：進(jìn)口高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、限制性內(nèi)切酶Kpnl和Bglll、T,DNA連接酶（ThermoFisher公司）；進(jìn)口胎牛血清（ScienCell公司）；普通DXA
6、聚合酶以及DNA高保真酶（TaKaRa公司）；5000和2000DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物（北京擎科公司）；質(zhì)粒提取試劑盒以及膠冋收試劑盒（Omega公司）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司）；單管發(fā)光儀（TurnerBiosystems公司）；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒（Promega公司）。1.2細(xì)胞培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞釆用常規(guī)方法培養(yǎng)，用10mL進(jìn)U胎牛血清和1mL青霉素-鏈霉素溶液（青霉素含量為10kU/mL，鏈霉素含量為10mg/mL）加入至90mL進(jìn)門高糖培養(yǎng)棊屮作為細(xì)胞焙養(yǎng)棊，將11EK-29
7、3細(xì)胞置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3重組報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以Ensembl中ISL1-001序列為模板,用Primer5.0設(shè)計(jì)引物,上下游引物5’端分別加入限制性內(nèi)切酶Kpnl、BglII的酶切位點(diǎn)及保護(hù)位點(diǎn)，共用下游引物為5’-GGAAGATCTGCTGTGGCTAAGTGGG-AAA-3’，上游引物分別為Pl（pGL-1215/+204)GL-870/+204)GL-670/+204)GL-450/+204)GL-273/+204)GL-173/+204)GL-1/+204):5’
8、點(diǎn)o:5’-CGGGGTACCCCGTAACAGATGATGGGAACA-3’；P2(p5’-CGGGGTACCATCATTTCG-CTCTTTGGC-3’；P3(p5，-CGGGG-TACCAGACGGAGTAATGGTGTAGCA-3,;P4(p5’-CGGGGTACCGGAGGGACCTCGT-CAACA-3';P5(p5，-CGGGGTACC-GAAGGAAGAGGAAGAGGAGGAG-3,;P6(p5，-CGGGG
