豬瘟活疫苗（兔源）組織毒生產(chǎn)及其貯存方法比較研究

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1、豬瘟活疫苗（兔源）組織毒生產(chǎn)及其貯存方法比較研究魯立柱/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院王燕平/新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司制藥事業(yè)部我國(guó)自1956年開(kāi)始推廣豬瘟兔化弱毒疫苗時(shí)，首先是取家兔的淋巴結(jié)和脾組織就地制造的濕苗，隨制隨用。1958年研制成功冷凍干燥疫苗，適用于工廠化生產(chǎn)，時(shí)至今日仍然采用相同的生產(chǎn)工藝，豬瘟脾淋苗以其抗原性好，過(guò)敏率低，免疫后快速產(chǎn)生免疫力等優(yōu)點(diǎn)深受廣大養(yǎng)殖戶的喜愛(ài)，但其組織毒生產(chǎn)工藝繁瑣，人員工作量大，綜合成本高等諸多缺點(diǎn)也限制了其產(chǎn)量。通過(guò)對(duì)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，從降低測(cè)溫次數(shù)、提高組織收獲量、增加組織保存期限三方面著手，降低

2、生產(chǎn)成本，提高組織毒生產(chǎn)安排的靈活性，以達(dá)到保證產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)上有效提高疫苗產(chǎn)量的目的。一、材料與方法1.材料。豬瘟病毒：豬瘟兔化弱毒，F(xiàn)0代豬瘟兔化弱毒（C株）凍干種毒購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供；脾淋組織毒由本公司豬瘟生產(chǎn)組提供。試劑：注射用水，由本廠制水站提供；滅菌生理鹽水、Hankacute;s液、5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護(hù)劑等自行配制，消毒后備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重為2.0～2.5kg健康的純系加利福尼亞兔，未注射過(guò)兔瘟疫苗，基礎(chǔ)體溫應(yīng)在39.3℃～39.7℃之間，且波動(dòng)小于0.5℃，由新疆鄯善縣綠洲兔業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)提供。2.方法。（1）生產(chǎn)病毒最

3、佳接種量和收毒部位的確定方法。先將凍干毒種用滅菌生理鹽水制成50倍稀釋的乳劑，耳靜脈注射家兔6只，每只1ml。注射后按照規(guī)程規(guī)定的效力檢驗(yàn)方法，選取熱型反應(yīng)為定型熱的家兔3只，在溫度下降后24h內(nèi)剖殺，以無(wú)菌手術(shù)采取家兔肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)，采毒時(shí)切勿剪破胃、腸、食道，以免污染。然后，將收獲的組織分別碾磨，用滅菌生理鹽水稀釋成1×10-4、2×10-4、3×10-4兔體感染量/克的乳劑，耳靜脈注射家兔2只，每只1ml，按照規(guī)程規(guī)定的效力檢驗(yàn)方法判定家兔熱型。（2）組織毒使用不同保護(hù)劑在不同溫度下的保存期試驗(yàn)方法。將制備的兔瘟組織毒

4、，稱重，研磨，平均分成四份，分別使用滅菌生理鹽水、Hankacute;s液、5%蔗糖脫脂牛奶和豬瘟耐熱保護(hù)劑制備成10倍稀釋的乳劑。再以2.0×10-4兔體感染量/克作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將各組試驗(yàn)樣用滅菌生理鹽水稀釋成2.0×10-4兔體感染量/克的乳劑，各組試驗(yàn)樣分別置于-70℃、-15℃、2℃～8℃環(huán)境貯存，于7日、30日、60日、90日、120日、150日分別耳靜脈注射家兔2只，每只1ml。按照規(guī)程規(guī)定的效力檢驗(yàn)方法判定熱型反應(yīng)，檢查各試驗(yàn)樣的基礎(chǔ)病毒含量是否≤2.0×10-4兔體感染量/克。二、結(jié)果1．脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)組織生

5、產(chǎn)病毒的收率比較。實(shí)驗(yàn)兔脾臟平均重量在2～3g，在腹腔內(nèi)胃大彎部，易于收獲，且無(wú)其它組織粘連，收獲中也不易產(chǎn)生污染，各方面條件都適用于組織苗的生產(chǎn)。肝臟質(zhì)量大，平均在80～120g是脾臟的2～40倍，而且收獲容易，不易造成污染，重量大是其最大的優(yōu)勢(shì)，腸系膜淋巴結(jié)在腹腔內(nèi)腸系膜中心位置，其平均重量在4～5g，被大量脂肪組織包圍，收獲時(shí)不易剝離，不小心容易剪破腸道造成污染。頜下淋巴結(jié)位于皮膚與下頜骨之間，平均重量為0.3～0.5g，體積過(guò)小收獲時(shí)不易剝離，而且在宰殺兔子時(shí)，放血過(guò)程中容易切破此部位造成污染。表略2.各組織不同稀釋度熱型反應(yīng)判定結(jié)果。按

6、照規(guī)程效力檢驗(yàn)的方法，檢測(cè)脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)的病毒含量，經(jīng)熱型判斷，結(jié)果良好，達(dá)到了生產(chǎn)要求的配苗標(biāo)準(zhǔn)，脾臟病毒含量最高，腸系膜淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)稍低于脾臟，肝臟的病毒含量未達(dá)到生產(chǎn)配苗的要求。表略3.各種保護(hù)劑保存的組織毒在不同溫度下保存7日、30日、60日、90日、120日、150日后的病毒含量保持情況。根據(jù)病毒含量測(cè)定結(jié)果，生理鹽水和Hank’s液保存的組織，只有在-70℃時(shí)能夠維持組織病毒含量到150日以上。-15℃保存組織，生理鹽水保存的組織病毒含量會(huì)迅速降低，Hank’s保存的組織病毒含量可以維持到60日，仍能達(dá)到配苗要求

7、。豬瘟耐熱保護(hù)劑和5%蔗糖脫脂牛奶保存的組織病毒在冷凍保存下，保存時(shí)間能夠到達(dá)150d以上。2℃～8℃冷藏保存，5%蔗糖脫脂牛奶保存的組織在第7日時(shí)病毒含量就已經(jīng)不符合配苗要求了，豬瘟耐熱保護(hù)劑保存的組織可以維持到120d以上。表略4.四種保護(hù)劑優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比。對(duì)四種保護(hù)劑從保存效果和經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性方面對(duì)比分析，5%蔗糖脫脂牛奶，最適合在生產(chǎn)中使用，生理鹽水和Hankacute;s液雖然經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，操作方便，對(duì)配苗影響也不大，對(duì)組織毒的保存效果不理想，不能達(dá)到長(zhǎng)期保存組織毒的目的，豬瘟耐熱保護(hù)劑，對(duì)組織病毒含量保存的很好，但價(jià)格較高，且容易凝固影響配苗

8、，所以在生產(chǎn)中不便于使用，5%蔗糖脫脂牛奶，保存效果良好，其本身就是凍干保護(hù)劑，對(duì)于產(chǎn)品后期配苗凍干過(guò)程無(wú)影響。表略三、討論豬瘟活疫苗(