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1、胎盤多肽注射液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響【關(guān)鍵詞】胎盤；細(xì)胞計(jì)數(shù)；免疫組織化學(xué)；胎盤多肽；內(nèi)皮細(xì)胞［Abstract］Objective:Toinvestigatetheeffectsofplacentapolypeptideontheproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcell(ECV-304)invitro.Methods：ECV-304cellsetry,andMTTin72h.Proliferatingcellnuclearantigen(PA)munohistochemistrymethodatthesametime.Res
2、ults：intherangeof25~400ml/L,placentapolypeptideshoannerandthemaximaleffectshol/L.PositivePAexpressionofECV-304correlatedotetheproliferationofECV-304invitro.［Keymunohistochemistry;placentspolypeptide;endothelialcell 近年來(lái)，隨著人們對(duì)胎盤研究的逐步深入，胎盤的加工從簡(jiǎn)單的烘干與水煮發(fā)展到生物萃取，使人們對(duì)胎盤所含的生物活性物質(zhì)及其功能有了更深入的認(rèn)識(shí)［1］。2007年3~10
3、月通過(guò)測(cè)定胎盤多肽注射液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)增殖可能產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步研究利用胎盤多肽對(duì)血管內(nèi)皮進(jìn)行修復(fù)做初步的探討。1材料與方法1.1材料1.1.1胎盤多肽注射液貴州益康制藥有限公司惠贈(zèng)。批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20046260，4ml/支。1.1.2細(xì)胞株ECV-304購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。1.1.3主要試劑RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT和二甲亞砜（國(guó)產(chǎn)分析純）。增殖細(xì)胞核抗原PA免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。1.1.4儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)FORMA公司）、倒置相差顯微鏡（日本NIKON公司
4、）、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Rad公司)。1.2方法和步驟1.2.1藥物及細(xì)胞處理將胎盤多肽注射液用含0.4%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成下列稀釋度：200、100、50、25、12.5ml/L。4℃保存?zhèn)溆?。ECV-304培養(yǎng)至單層，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV-304細(xì)胞，0.25%胰酶消化后,用含10%胎牛血清的RPMI1640制成細(xì)胞懸液，以8×104/ml接種于96孔板，每孔100μl。待細(xì)胞貼壁后換成含不同稀釋度胎盤多肽注射液的維持培養(yǎng)液（含0.4%胎牛血清）,并設(shè)對(duì)照，每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。加
5、藥后72h各劑量組做細(xì)胞計(jì)數(shù),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。1.2.4增殖細(xì)胞核抗原（PA）的表達(dá)在6孔板中預(yù)置蓋玻片，以8×104/ml接種ECV-304于6孔板，每孔1ml,并在每孔中補(bǔ)加1ml培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后換成含不同稀釋度胎盤多肽的維持培養(yǎng)液。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，取出蓋玻片，用4℃冷丙酮固定后，以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原PA的表達(dá)情況。ECV-304染色陽(yáng)性率計(jì)算方法：分別在4個(gè)高倍視野下，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。2結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表中可見(jiàn)，與ECV-304共培養(yǎng)72h，除12.5ml/L組細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組無(wú)差異，
6、其余不同稀釋度的胎盤多肽處理組較對(duì)照組差異有顯著性；胎盤多肽可促進(jìn)ECV-304的增殖，且呈劑量相關(guān)性，最小劑量為25ml/L，在200ml/L時(shí)發(fā)揮最大作用（P﹤0.05）。MTT比色結(jié)果顯示，12.5ml/L組細(xì)胞OD值與對(duì)照組無(wú)差異，其余各組OD值與對(duì)照組存有差異，胎盤多肽可促進(jìn)ECV-304的增殖，且呈劑量相關(guān)性，最小劑量為25ml/L，在200ml/L時(shí)發(fā)揮最大作用（P﹤0.05）。PA的表達(dá)各組均陽(yáng)性，除12.5ml/L組外，各組陽(yáng)性細(xì)胞率與細(xì)胞對(duì)照組均存有差異，且呈劑量相關(guān)性，最小劑量為25ml/L，在200ml/L時(shí)發(fā)揮最大作用（P﹤0.05）。表1不同稀釋度胎盤多肽72
7、h對(duì)ECV-304細(xì)胞數(shù)量、增殖、PA表達(dá)的影響3討論 當(dāng)前，如晚期冠狀動(dòng)脈病變這樣的缺血性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，也成為我國(guó)病死率和病殘率不斷上升的主要原因［2］。血管新生是個(gè)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)研究表明，血管新生和重建是一個(gè)逐步的過(guò)程，在此過(guò)程中的不同階段，有如VEGF、bFGF和Angiopoietin-1等多種誘導(dǎo)因子參與。這些因子的參與對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成均勻一致的初始血管網(wǎng)和后期重塑均有重要作用［3~5］。如僅用單一
