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1、鈣蛋白酶抑制劑對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用【摘要】目的:研究calpain抑制劑（ALLN）對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常灌注組、缺血/再灌注組、ALLN+正常灌注組、ALLN+缺血/再灌注組和二甲亞砜+缺血/再灌注組,分別檢測再灌注15min時(shí)冠狀動(dòng)脈流出量（CF）和冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)漏出量，熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度來反映calpain活性，免疫印跡法檢測心肌細(xì)胞calpain蛋白表達(dá)量，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率，并計(jì)算凋亡指數(shù)。結(jié)果：同缺血/
2、再灌注組相比，ALLN+缺血/再灌注組CF顯著增高（P<0.01），LDH漏出量、calpain活性和蛋白表達(dá)量、胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論:ALLN對離體心臟缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用,可能與其抑制calpain活性，從而減輕calpain對細(xì)胞的損傷，減輕了細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】鈣蛋白酶；缺血再灌注損傷；鈣離子；凋亡鈣蛋白酶（calpain）是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，廣泛存在于包括心臟在內(nèi)的各種組織細(xì)胞中，在體內(nèi)calpain可被鈣離子激活后對特定的底物進(jìn)行限制性水解，參與了細(xì)胞增殖、分化、
3、遷移和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能［1］。calpain的異常激活則參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)退行性病、外傷性腦損傷和脊髓損傷等，而對其在心臟病理?xiàng)l件下的作用研究不是很多。本試驗(yàn)利用calpain特異性抑制劑，觀察其對離體大鼠心臟缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷的影響，旨在探討calpain在I/R損傷中作用及可能的機(jī)制。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑和儀器calpain抑制劑(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗、FLU
4、O-3/AMFITC(美國Sigma公司)，SO)+I/R組，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15min，然后停止灌注30min，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40min。1.2.2乳酸脫氫酶(LDH)和冠狀動(dòng)脈流出量(CF)的測定收集再灌注15min時(shí)單位時(shí)間內(nèi)的CF，并應(yīng)用日立全自動(dòng)生化分析儀測定冠脈流出液中LDH的漏出量。1.2.3心肌勻漿制備去除心房和右心室，將剩余的心臟組織剪碎后加入10ml·（g組織）-1勻漿液（10mmol·L-1NaHCO3，5mmol·L-1NaN3，15mmol·L-1Tris-HCl，pH6.8），制成勻漿后離心
5、（10919×g，20min），收集上清，分裝儲(chǔ)存于-70℃，以上操作均在4℃進(jìn)行，蛋白濃度采用Bradford法測定。1.2.4calpain活性測定我們以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特異性作用底物）與calpain反應(yīng)釋放出AMC的熒光強(qiáng)度來代表不同樣品中calpain的活性［2］。取150μl的心肌勻漿液，加入1ml的反應(yīng)緩沖液（145mmol·L-1NaCl,100mmol·L-1Tris-HCl，pH7.3）37℃水浴箱中振蕩10min,再加入150μl的500μmol·L-1的N-Succinyl-Leu
6、-Tyr-AMC，在37℃水浴箱中振蕩60min后取1ml加入比色皿，在熒光分光光度計(jì)上用波長為360nm的光線激發(fā)后，測定在440nm處發(fā)射的熒光強(qiáng)度。用已知濃度的AMC作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的結(jié)果以ngAMC·min-1·(mg蛋白)-1表示。1.2.5液（終濃度為5mmol·L-1），混勻后避光37℃振蕩30min，去除負(fù)載液，用D-Hanks液洗滌3次，流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長526nm，每組樣品取10000個(gè)細(xì)胞，以平均熒光強(qiáng)度代表各組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混勻后-20℃保存。(2)凋亡的測
7、定：按照Annexin-Ⅴ-FLUOSStainingKIT使用說明，取30μlAnnexin-Ⅴ染料加入到1.5ml的結(jié)合緩沖液中，再加入30μlPI染料，充分混勻。每個(gè)細(xì)胞樣品中加入100μl的混合染料，混勻，避光室溫放置15min。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果判定Annexin-Ⅴ-／PI-為正常細(xì)胞，Annexin-Ⅴ+／PI-為凋亡細(xì)胞，Annexin-Ⅴ+／PI+為壞死細(xì)胞。每組樣品取10000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Annexin-Ⅴ+／PI-細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)。1.3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以x-±s表示，應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件
8、分析處理，并采用單因素方差檢驗(yàn)(ANOVA)分析組間差異的顯著性。若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較(SNK法)，P
