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1、家蠶蛹特異表達(dá)卵黃原蛋白基因功能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究第一章文獻(xiàn)綜述1.1昆蟲的繁殖在昆蟲中雌性的繁殖在卵巢中進(jìn)行。卵巢又分為卵巢管、輸卵管、受精囊、附腺、交配囊和產(chǎn)卵管[1]。卵巢管（ovariole)是卵巢中卵形成的部位。一般a蟲的卵巢管有4-10根，然而，一些物種中含有更多的卵巢管。卵巢管呈管狀，由體細(xì)胞和生殖細(xì)胞構(gòu)成。在每個(gè)卵巢管的尖端，一個(gè)生殖室儲(chǔ)藏基礎(chǔ)的生殖細(xì)胞。濾泡或卵室內(nèi)部形成原卵區(qū)，并使卵沿著卵巢管逐漸成熟。圖1.1是雌性家蠶(Bombyxmori,B.mori)內(nèi)部生殖器的構(gòu)造，包括卵巢管、輸卵管、受精囊、附腺、交配囊和產(chǎn)
2、卵管。在卵形成過(guò)程中，卵黃在卵母細(xì)胞內(nèi)大量積累，卵成熟時(shí)卵重的65%左右。卵黃是由各種大分子組成的復(fù)合物，包括蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物，其中蛋白質(zhì)是主要成分。因此，按其化學(xué)本質(zhì)可分為蛋白性、脂肪性和碳水化合物性卵黃。蛋白性卵黃里球狀，直徑1.5-9.8Mm，脂質(zhì)性卵黃主要是脂肪小滴，直徑1.4*4.6,碳水化合物性卵黃主要是糖原顆粒，直徑0.12nm。家蠶卵黃主要是由蛋白性卵黃球構(gòu)成，被稱為卵黃顆粒。其中以大型蛋白性卵黃球?yàn)樽疃?，脂肪小滴和糖原顆粒分散于蛋白性卵黃球之間。.1.2卵黃原蛋白卵黃原蛋白（Vitellogenin，Vg)是
3、卵黃憐蛋白（egg-yolkproteinvitellin，Vn)前體。它是卵生動(dòng)物特有的一類蛋白，主要功能是為胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。早在1954年首次在桑香屬中被證實(shí)為一種雌特異的血液蛋白[26]昆蟲中，Vg的合成具有組織、性別和發(fā)育時(shí)期的特異性。它首先在雌性脂肪體中合成，分泌到血液，再通過(guò)胞吞的方式進(jìn)入卵母細(xì)胞[27]。Vg被吸收到卵內(nèi)，在枯草桿菌蛋白內(nèi)切酶和蛋白前體轉(zhuǎn)化酶的作用下切割成50-180kDa的亞基[28-29]，而以卵黃磷蛋白的形式存在。這些酶識(shí)別保守的基序(R/K)XX(R/K)作為切割位點(diǎn)，而這些基序在所有的昆蟲V
4、gs氨基酸序列中都能找到[3]。在半變態(tài)的昆蟲像P.americcma、Riptortusclavatus,Vg的初產(chǎn)物切割成多個(gè)亞基；而在完全變態(tài)的昆蟲中，Vg的初始產(chǎn)物切割成一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基;與其他的膜翅目昆蟲一樣Vg在Pimpitipponiccj中并不被切割（Fig.1.3)。盡管其他的麟翅目昆蟲的Vgs般被切割成大小兩個(gè)亞基，但在草地貪夜蛾Sjporfoipfera的血淋巴和卵巢提取物中只檢測(cè)到一種蛋白形式[30]。不同物種中的Vg基因的數(shù)目也不盡相同。果蠅Drosophilamelanogaster有三個(gè)卵黃蛋白基因
5、（yolkprotein，Yp)Ypl,取2和其中在雌蠶脂肪體中特異表達(dá)而則在卵巢濾泡細(xì)胞中特異表達(dá)[31-32]。這種組織，時(shí)期的特異性的轉(zhuǎn)錄是由組織特異的增強(qiáng)子，蛻皮激素和保幼激素共同調(diào)控的[33]。而在蚊子中有五個(gè)Vg基因，在雌性成蟲食血后開始特異高量表達(dá)[34]?家蠶S.mon只有一個(gè)卵黃原蛋白基因(BmVg),在1994年被鑒定。它主要是在雌性幼蟲到蛹變態(tài)期開始合成[35]。.第二章引言2.1研究背景昆蟲是地球上數(shù)量最多的動(dòng)物群體，它們的蹤跡幾乎遍布世界的每一個(gè)角落。目前，人類已知的昆蟲約有100力種，但仍有許多種類尚待發(fā)現(xiàn)
6、。它以超強(qiáng)的繁殖能力著稱，卵黃原蛋白作為昆蟲胚胎的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)長(zhǎng)期以來(lái)是研究者們廣為關(guān)注的問(wèn)題。從上世紀(jì)50年代Telfer從多音天蠶血液中分離得到這個(gè)血液特異的蛋白后，研究者從不同種類的昆蟲中純化卵黃原蛋白，克隆并分析不同物種中卵黃原蛋白基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因的轉(zhuǎn)錄具有組織、時(shí)期和性別特異性，發(fā)現(xiàn)不同物種中脫皮激素和保幼激素對(duì)卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響不同，在紋子和果頓的研究進(jìn)一步闡述了卵黃原蛋白基因的組織、時(shí)期特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。在絕大多數(shù)昆蟲中，卵黃蛋白的組成較簡(jiǎn)單，卵黃原/卵黃憐蛋白占卵黃蛋白的80%以上，被認(rèn)為是胚胎發(fā)
7、育過(guò)程中必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。而在有些麟翅目昆蟲中，卵黃蛋白組成較復(fù)雜。例如在家蠶中由40%Vn、35%30KP蛋白和25%ESP組成。這種成份上的差異是否對(duì)卵黃原蛋白的重要性有所影響呢？.2.2研究?jī)?nèi)容結(jié)合家査基因表達(dá)芯片結(jié)果分析BmVg在雌雄個(gè)體中的轉(zhuǎn)錄趨勢(shì)，然后用RT-PCR對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證；SA實(shí)驗(yàn)分析BrC-Z2元件與有活性的BmBrC-Z2蛋白結(jié)合；過(guò)表達(dá)BmBrC-Zl、Z2和Z4轉(zhuǎn)錄因子分析說(shuō)皮激素對(duì)BmVg啟動(dòng)子的作用是通過(guò)BinBrC-Z2調(diào)控的；定量PCR和免疫組化分析在家蠶幼蟲-蛹變態(tài)過(guò)程中BmBrC-Z2與BmVg合成
8、的趨勢(shì);利用RNAi實(shí)驗(yàn)特異下調(diào)BniBrC-Z2在雌蠶的表達(dá)，分析BmVg的合成及卵的形成、胚胎發(fā)育；..第三章家蠶卵黃原蛋白基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征..........193.1材料與方法.........193.1.1
