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1、Survivin基因干擾RNA對骨肉瘤MG作者：李鯤，楊述華，劉紅云，吳強(qiáng)，傅德皓【關(guān)鍵詞】骨肉瘤摘要：［目的］觀察Survivin基因siRNA表達(dá)載體對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。［方法］體外構(gòu)建SurvivinshRNA表達(dá)載體pSilence21neoSurvivin，轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG63，篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，RTPCR、TT）法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖情況，吖啶橙熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況。［結(jié)果］轉(zhuǎn)染后MG63細(xì)胞Survivin基因mRNA水平和蛋白
2、表達(dá)顯著下降，其抑制率分別為8508％和8114％；細(xì)胞增殖受到顯著抑制，培養(yǎng)48h后與空白組比較，抑制率達(dá)6341％；吖啶橙染色顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯核碎裂等凋亡改變，轉(zhuǎn)染組凋亡率為2454％。［結(jié)論］靶向Survivin基因的siRNA表達(dá)載體可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞：Survivin；siRNA；短發(fā)夾狀RNA；骨肉瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡Abstract：［Objective］ToconstructanexpressionplasmidofashorthairpinRNAta
3、rgetingSurvivin,andinvestigateitseffectontheexpressionofSurvivin,theproliferationandtheapoptosisofhumanosteosaracelllineMG63invitro［Method］AplasmidofashorthairpinRNAtargetingSurvivinalmethodMorphologicalchangeoftumorcellsicroscopeTheexpressionofSurvivinmR
4、NAandprotEininedbyRTPCRandTTmethodandthecolonyformingtestTheapoptoticcellsberofdriftcellsRNAandprotEInTheexpressionofSurvivinmRNAandproteinaftertransfectionethodandtheinhibitionratereached6341%at48h,theapoptosisrateofthecellsinthetransfectedgroupRNAandpro
5、teinandinhibittheproliferationoftheMG63cell,andincreasetheapoptosisofthecellsKeyine2000為Invitrogen公司產(chǎn)品，pSilence21neo為Ambin公司產(chǎn)品，購自武漢晶賽公司，RTPCR試劑盒為MBI公司產(chǎn)品，鼠抗人Survivin單克隆抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)試劑均購自Gibico公司。12實(shí)驗(yàn)方法121pSilence21neoSurvivin表達(dá)載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Harbort
6、h等〔2〕的干涉RNA設(shè)計(jì)原則，以人Survivin的mRNA序列5TTCGTCCGGTTGCGCTTTC3為靶點(diǎn)，體外合成兩端帶有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位點(diǎn)、內(nèi)含5TTCGTCCGGTTGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCAACCGGACGAA3發(fā)夾狀序列的雙鏈DNA，將合成的片段接入pSilence21neo載體，篩選、擴(kuò)增后經(jīng)測序證實(shí)構(gòu)建成功。分4組進(jìn)行處理：空白組、脂質(zhì)體組、空載體組、shRNA組，轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體使用說明書進(jìn)行?？蛰d體組和shRNA組轉(zhuǎn)染后72h，以G41
7、8篩檢14d，挑出陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。122RTPCR檢測細(xì)胞SurvivinmRNA的表達(dá)分別收集各組細(xì)胞，參照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)反應(yīng)。引物的序列為：Survivin：上游：5′ATGGGTGCCCCGACGTTG3′下游：5′AGAGGCCTCAATCCATGG3′，擴(kuò)增產(chǎn)物436bp。同時(shí)以βactin：上游：5′TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3′下游：5′CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT3′為反應(yīng)內(nèi)參（擴(kuò)增片段172bp）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2
8、％瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線下觀察并計(jì)算各條帶的積分吸光度（IA），以Survivin與βactin的IA比值表示SurvivinmRNA的相對含量。123TT法檢測細(xì)胞活性將對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，按6×103個／孔分別接種到96孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)24、48、72、96h后收集上述4組細(xì)胞，MTT法，酶標(biāo)儀下570nm波長測OD值，每組3孔，重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=（空白組OD值處理組OD值）／空白組OD
