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1、代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸MetabolicengineeringofCorynebacteriumglutamicumfor5-aminolevulinicacidproduction學(xué)科專(zhuān)業(yè)：生物化工研究生：鄒亞蘭指導(dǎo)教師：陳濤副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一七年五月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得天津大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研
2、究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說(shuō)明）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日中文摘要5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用，微生物發(fā)酵合成5-
3、ALA顯示了重要應(yīng)用前景。本文利用谷氨酸棒桿菌代謝工程合成5-ALA，C4途徑代謝工程改造中，研究了血紅素合成途徑、甘氨酸途徑、5-ALA運(yùn)輸?shù)鞍椎倪^(guò)表達(dá)對(duì)5-ALA合成的影響；C5途徑代謝工程改造中，研究了關(guān)鍵酶基因hemL和hemA共表達(dá)對(duì)5-ALA合成的影響。血紅素合成途徑基因擾動(dòng)對(duì)5-ALA合成的影響。首先，改變heme合成途徑中的hemH和hemY基因的初始密碼子（ATG-GTG），結(jié)果表明下調(diào)hemH和hemY基因的表達(dá)水平分別使5-ALA的產(chǎn)量提高14.0%和5.3%；IPTG誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)下游基因hemB、hemC、he
4、mD、hemE、hemN、hemH，不同血紅素合成相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)5-ALA的合成影響不盡相同，其中hemC、hemN基因在不添加IPTG的本底表達(dá)水平下顯著促進(jìn)了5-ALA的合成分別提高295%和12.9%；而添加IPTG進(jìn)一步提高上列6個(gè)基因的表達(dá)水平均會(huì)導(dǎo)致5-ALA的產(chǎn)量顯著下降。通過(guò)同工酶氨基酸序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌5-ALA潛在運(yùn)輸?shù)鞍谆騈cgl2065及Ncgl0580基因，利用低拷貝質(zhì)粒pEP2對(duì)其進(jìn)行過(guò)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，分別過(guò)表達(dá)Ncgl2065及Ncgl0580的工程菌C.glutamicumR1
5、及R2，5-ALA的產(chǎn)量分別提高了129.5%和100.4%，產(chǎn)量分別達(dá)到1.90±0.1g/L和1.84±0.2g/L。隨后考察了絲氨酸以及甘氨酸合成途徑對(duì)5-ALA合成的影響。在工程菌C.glutamicumAG3中添加不同濃度的甘氨酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，5-ALA的產(chǎn)量會(huì)隨著甘氨酸濃度的增加而增加，添加7.5g/L甘氨酸，AG3生產(chǎn)的5-ALA達(dá)到2.72g/L，比C.glutamicumAP2的產(chǎn)量高出了39.5%。為了驗(yàn)證絲氨酸以及甘氨酸反應(yīng)在5-ALA合成中的作用，通過(guò)不同強(qiáng)度地表達(dá)以及絲氨酸添加，證明了相對(duì)于絲
6、氨酸來(lái)說(shuō)，glyA反應(yīng)是限速步驟，但是絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)的表達(dá)量應(yīng)該適度，并不是越強(qiáng)越好。在利用C5途徑生產(chǎn)5-ALA的過(guò)程中，合成了來(lái)源于Salmonellatyphimurium的hemA基因并進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，同時(shí)在該基因第二個(gè)以及第三個(gè)密碼子之間引入AAGAAG，在表達(dá)hemA的基礎(chǔ)上，分別表達(dá)來(lái)源于S.typhimurium和Escherichiacoli的hemL基因，與前者相比，后者表達(dá)后的5-ALA的產(chǎn)量提高了3.3倍。關(guān)鍵詞：谷氨酸棒桿菌，5-氨基乙酰丙酸，血紅素，甘氨酸IABSTRACT5-amino
7、levulinicacid(5-ALA)playsimportantrolesinmedicineandagriculture,andsynthesisof5-ALAbymicrobesshowsapplicationprospect.Inthisstudy,hemebiosynthesispathway,glycinebiosynthesispathwayandtransporterproteinsof5-ALAofC.glutamicumwereresearchedbasedonC4pathway.Co-overexpressi
8、onofcodon-optimizedhemAofSalmonellatyphimuriumandhemLofEscherichiacoliwerestudiedfortheireffectson5-ALAproduction.Int
