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《絲氨酸谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造和ppt課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、產L-絲氨酸谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造和 代謝流分析1L-絲氨酸L-絲氨酸在生物體生理和代謝過程中具有不可替代的作用:1）它可以為哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的生長和發(fā)育提供營養(yǎng)2）它還是胞內多種重要生物物質合成所需的一碳單位(C1units)的直接供體,參與氨基酸、嘌呤、嘧啶、磷脂等的合成.2本研究采用系統(tǒng)代謝工程策略,構建了基因工程菌CorynebacteriumglutamicumSER-8.連續(xù)補料發(fā)酵實驗顯示,SER-8的比生長速率降低,L-絲氨酸的積累量在不同的生長時期呈現(xiàn)變化.代謝流分析證明,過表達3-磷酸甘油酸激酶使糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)增強,過表達脫敏型3-磷酸甘油酸脫
2、氫酶加強了L-絲氨酸合成途徑.敲除激活蛋白GlyR部分減弱了L-絲氨酸向甘氨酸的轉化,代謝流比率仍有38.2%.3首先,糖酵解的代謝中間產物3-磷酸甘油酸在3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH,serA編碼)的作用下氧化為3-磷酸羥基丙酮酸;然后在轉氨酶(PSAT,serC編碼)的作用下3-磷酸羥基丙酮酸與谷氨酸之間進行氨基的轉移,形成3-磷酸絲氨酸;最后在磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP,serB編碼)的作用下3-磷酸絲氨酸水解生成L-絲氨酸.L-絲氨酸在C.glutamicum中通過磷酸化途徑合成過程4實驗過程1）質粒和菌株構建2）搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵3）胞內代謝物測定——樣品預處理、淬取和抽
3、提4）分析5基因敲除.使用含sacB反篩標記的自殺載體進行基因組上目的基因的無痕敲除(2)基因過表達.為增加L-絲氨酸合成的體供應量,構建了分別含有pgk和serAr的單基因表達載體.6種子搖瓶培養(yǎng):將BHI斜面活化的菌體接入含有50mL種子培養(yǎng)基CGIII的三角瓶中,在30℃,200r/min下振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期,菌體密度達到12.發(fā)酵搖瓶培養(yǎng):接種量為1mL,500mL擋板三角瓶裝液量為30mL,添加2%碳酸鈣.發(fā)酵在30℃,120r/min下培養(yǎng)72h.補加濃氨水調節(jié)發(fā)酵液的pH在7.0~7.2之間.7.5L罐發(fā)酵培養(yǎng):接種量為3%,裝液量為2L,溫度控制在30℃,自動流
4、加濃氨水控制pH在7.2,溶氧維持在30%以上.初始葡萄糖為20g/L,當殘?zhí)堑陀?0g/L時,流加400g/L的葡萄糖.發(fā)酵連續(xù)進行60h.當A600=2時,加入0.8mmol/LIPTG誘導重組質粒攜帶的基因表達.77.5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)至菌體生長的對數(shù)生長期中期抽取5mL發(fā)酵液,注入20mL淬取劑中(60%甲醇,70mmol/LHepes,-80℃預冷),于20℃,5200×g離心10min,倒掉上清,菌體保存-80℃.采用高溫煮沸釋放內含物的方法抽提胞內代謝物.將菌體在90℃加熱5min,連續(xù)進行3次抽提.抽提后放置室溫,用真空泵風干.加入500μL無菌蒸餾水溶解內含物,
5、5500×g離心10min,上清保存于-80℃.為了減少菌株SER-8與對照SER-0之間取樣的差異提高數(shù)據(jù)準確度,選用在CGX基本培養(yǎng)基,初始葡萄糖濃度為40g/L的批次發(fā)酵的樣品進行胞內代謝物的測定.8生物量測定葡萄糖濃度測定L-絲氨酸含量測定9結果討論本實驗結果顯示敲除激活蛋白GlyR,在一定程度上可以降低L-絲氨酸轉化為甘氨酸,但該通路代謝流比率分配仍有38.2%,進一步印證了SHMT催化的L-絲氨酸轉化為甘氨酸是限制L-絲氨酸積累的關鍵節(jié)點.本研究進一步證明增加前體物供給有助于提高L-絲氨酸的生物合成.本實驗結果表明胞內L-絲氨酸的代謝對維持C.glutamicum的生
6、長至關重要.10展望本研究結果不僅為未來L-絲氨酸代謝工程改造提供了新的靶點,而且能夠對C.glutamicum利用葡萄糖直接發(fā)酵法生產L-絲氨酸提供科學前提和研究基礎,從而為工業(yè)微生物菌株的選育提供新的思路.11謝謝觀賞！12
